实验——外界因素对细菌的影响
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实验三 外界因素对细菌的影响
实验内容
物理消毒灭菌法 化学因素和生物因素对细菌的影响
目的要求
熟悉紫外线对细菌的杀灭作用。 初步掌握细菌对常用抗菌药物和化学
消毒剂敏感性测定的方法。 了解实验室常用灭菌器的使用方法。
一、紫外线对细菌的杀灭作用
【原理】 紫外线中波长为200～300nm者具有 杀菌能力。其中265～266nm的杀菌 作用最强，紫外线除日光中含有一部 分外，医学上使用的常以人工紫外线 灯产生；其杀菌机制是干扰细菌DNA 的合成。特点是穿透力较弱。
平板纸片法示意图
0.1％新洁尔灭 2%碘酒 1%龙胆紫
2%红汞
3．37℃孵育24小时，观察各消毒剂纸 片周围有无抑菌圈，比较各抑菌圈的 大小。
观察记录结果，并比较不同细对相同 化学消毒剂的敏感性以及同一细菌对 不同化学消毒剂的敏感性。
三、细菌对常用抗生素的敏感度测定
以滤纸圆片浸沾一定稀释度的药物， 贴附于已涂满被测细菌的琼脂平板培 养基上，孵育后，因药物的抑菌作用 及渗透性，纸片周围可以有抑菌圈出 现，据根抑菌圈的有无和大小，以测 知该菌对这些药物的敏感性，但准确 度不如试管法。
3．打开两皿皿盖，在离水银灯约1米处， 直接受紫外线照射30分钟后，以镊子 取出纸片，将纸片投放消毒缸内，盖 好皿盖，37℃孵育24小时后观察生长 情况。
观察记录结果
二、常见化学消毒剂的杀菌作用
【材料】 1．菌种：葡萄球菌、大肠杆菌18～24
小时肉汤培养基。 2．培养基：琼脂平板。 3．0.1％新洁尔灭、1％龙胆紫、2％ 碘
料、玻璃器材、传染性污物及细菌培 养物等都可用本法消毒灭菌。
（三）干热灭菌器
干热灭菌器（干烤箱）是由双层铁板制成 的长方形或正方形金属箱，外壁内层装有 隔热的石棉板。在烤箱中装置电热线圈， 上有小孔，按插温度计供通空气用，箱前 有铁门及玻璃门，箱内有金属板架数层， 电热烤箱的前下方装有温度调节器，可以 保持所需的温度（见图3-5）。
【材料】
1．菌种：金黄色葡萄球菌，伤寒杆菌18～ 24小时肉汤培养物。
2．培养基：普通琼脂平板。 3．各种抗生素及磺胺药的干燥滤纸小圆片
【方法】
1．分别将金黄色葡萄球菌及伤寒杆菌密布于 两只琼脂平板表面。
2．每一种细菌的琼脂平板上，分别放置磺 胺药、青霉素、链霉素、氯霉素和金霉素 的干燥药物滤纸圆片，各片间距要相等。 3．37℃孵育18～24小时后，观察抑菌圈的 有无及大小。
高压蒸汽灭菌器(手提式）
பைடு நூலகம்
2．用法：加水至器内，放入被灭菌 物品，将器盖盖上，螺旋转紧使之密 闭。器下用煤气或电炉等加热，同时 开排气阀门，使器内冷空气完全逸出， 否则压力表上可示压力并非全部蒸汽 压力，灭菌将不完全。
横卧式高压蒸汽灭菌器剖面图
3.用途：高压蒸汽灭菌为最可靠方法， 凡耐高热的潮湿的物件，如培养基、 生理盐水、衣物、 纱布、棉花等敷
电热恒温干烤箱示意图
电热同恒一温温度干下烤，箱湿热灭菌比干热灭菌效果好
【用法】
培养皿、吸管、试管等玻璃器材包装后放 人箱内，闭门加热，当温度上升至160～ 170℃时，保持2小时。到达时间后，停止 加热，待温度自然下降至40℃以下，方可 开门取物，否则冷空气突然进入，易引起 玻璃炸裂，且热空气外溢，往往会烧伤取 物者的皮肤。一般吸管、试管、培养皿、 凡士林、液体石蜡等用本法灭菌。
酒、 2％红汞、6.5毫米直径的灭菌滤 纸圆片、镊子。
【方法】
1．分别以接种环沾取葡萄球菌或大肠杆菌培 养物数环，作来回连续划线，使密密涂满 于两只琼脂平板培养基表面。
2．以镊子夹取灭菌圆形滤纸小片各两张，分 别浸于消毒剂内，再一一取出，并令纸片 与试管内壁接触，去除多余药液后，分别 放在已种有细菌的琼脂平板表面的中央及 四 周 ， 各 纸 片 间 的 距 离 要 大 致 相 等 （ 图 32）。
【材料】
1.菌种：大肠杆菌18～24小时肉汤培养物， 枯草杆菌24～48小时肉汤培养物。
2.培养基：普通琼脂平板。 3.灭菌的三角形纸片、镊子、紫外线灯。
【方法】
1．用接种环沾取大肠杆菌和枯草杆菌培养物 数环，分别在两只琼脂平板培养基表面来回 密密涂满整个平板。
2．以镊子在火焰上迅速通过2～3次杀灭其表 面杂菌后，镊取三角形灭菌纸片两张，各放 一张在每一琼脂平板表面的中央。
（四）滤菌器
c玻质滤菌器
a姜伯朗氏滤菌器 b赛氏（左）和伯克菲尔（右）滤菌器
滤菌器使用时的滤过装置
滤菌器使用时的滤过装置
培养后平板上出现大小不等的抑菌圈
观察记录结果
按表3-1 抑菌环解释标准 来判读细菌 对各种抗生素的敏感度。
四、常用消毒灭菌器与滤菌器
（一）煮沸消毒器： 煮沸消毒器是用金属制成的有盖长方 形锅，锅内有一带孔的盘，底部有电 热装置。
用途：消毒注射器及解剖器械等
煮沸消毒器：
（二）高压蒸汽灭菌器
1．构造：高压蒸汽灭菌器是一个双层的金 属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上 或前方有金属厚盖（见图3-4）。盖旁附 有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢， 因而蒸汽压力升高，随着其温度亦相应的 增高
实验内容
物理消毒灭菌法 化学因素和生物因素对细菌的影响
目的要求
熟悉紫外线对细菌的杀灭作用。 初步掌握细菌对常用抗菌药物和化学
消毒剂敏感性测定的方法。 了解实验室常用灭菌器的使用方法。
一、紫外线对细菌的杀灭作用
【原理】 紫外线中波长为200～300nm者具有 杀菌能力。其中265～266nm的杀菌 作用最强，紫外线除日光中含有一部 分外，医学上使用的常以人工紫外线 灯产生；其杀菌机制是干扰细菌DNA 的合成。特点是穿透力较弱。
平板纸片法示意图
0.1％新洁尔灭 2%碘酒 1%龙胆紫
2%红汞
3．37℃孵育24小时，观察各消毒剂纸 片周围有无抑菌圈，比较各抑菌圈的 大小。
观察记录结果，并比较不同细对相同 化学消毒剂的敏感性以及同一细菌对 不同化学消毒剂的敏感性。
三、细菌对常用抗生素的敏感度测定
以滤纸圆片浸沾一定稀释度的药物， 贴附于已涂满被测细菌的琼脂平板培 养基上，孵育后，因药物的抑菌作用 及渗透性，纸片周围可以有抑菌圈出 现，据根抑菌圈的有无和大小，以测 知该菌对这些药物的敏感性，但准确 度不如试管法。
3．打开两皿皿盖，在离水银灯约1米处， 直接受紫外线照射30分钟后，以镊子 取出纸片，将纸片投放消毒缸内，盖 好皿盖，37℃孵育24小时后观察生长 情况。
观察记录结果
二、常见化学消毒剂的杀菌作用
【材料】 1．菌种：葡萄球菌、大肠杆菌18～24
小时肉汤培养基。 2．培养基：琼脂平板。 3．0.1％新洁尔灭、1％龙胆紫、2％ 碘
料、玻璃器材、传染性污物及细菌培 养物等都可用本法消毒灭菌。
（三）干热灭菌器
干热灭菌器（干烤箱）是由双层铁板制成 的长方形或正方形金属箱，外壁内层装有 隔热的石棉板。在烤箱中装置电热线圈， 上有小孔，按插温度计供通空气用，箱前 有铁门及玻璃门，箱内有金属板架数层， 电热烤箱的前下方装有温度调节器，可以 保持所需的温度（见图3-5）。
【材料】
1．菌种：金黄色葡萄球菌，伤寒杆菌18～ 24小时肉汤培养物。
2．培养基：普通琼脂平板。 3．各种抗生素及磺胺药的干燥滤纸小圆片
【方法】
1．分别将金黄色葡萄球菌及伤寒杆菌密布于 两只琼脂平板表面。
2．每一种细菌的琼脂平板上，分别放置磺 胺药、青霉素、链霉素、氯霉素和金霉素 的干燥药物滤纸圆片，各片间距要相等。 3．37℃孵育18～24小时后，观察抑菌圈的 有无及大小。
高压蒸汽灭菌器(手提式）
பைடு நூலகம்
2．用法：加水至器内，放入被灭菌 物品，将器盖盖上，螺旋转紧使之密 闭。器下用煤气或电炉等加热，同时 开排气阀门，使器内冷空气完全逸出， 否则压力表上可示压力并非全部蒸汽 压力，灭菌将不完全。
横卧式高压蒸汽灭菌器剖面图
3.用途：高压蒸汽灭菌为最可靠方法， 凡耐高热的潮湿的物件，如培养基、 生理盐水、衣物、 纱布、棉花等敷
电热恒温干烤箱示意图
电热同恒一温温度干下烤，箱湿热灭菌比干热灭菌效果好
【用法】
培养皿、吸管、试管等玻璃器材包装后放 人箱内，闭门加热，当温度上升至160～ 170℃时，保持2小时。到达时间后，停止 加热，待温度自然下降至40℃以下，方可 开门取物，否则冷空气突然进入，易引起 玻璃炸裂，且热空气外溢，往往会烧伤取 物者的皮肤。一般吸管、试管、培养皿、 凡士林、液体石蜡等用本法灭菌。
酒、 2％红汞、6.5毫米直径的灭菌滤 纸圆片、镊子。
【方法】
1．分别以接种环沾取葡萄球菌或大肠杆菌培 养物数环，作来回连续划线，使密密涂满 于两只琼脂平板培养基表面。
2．以镊子夹取灭菌圆形滤纸小片各两张，分 别浸于消毒剂内，再一一取出，并令纸片 与试管内壁接触，去除多余药液后，分别 放在已种有细菌的琼脂平板表面的中央及 四 周 ， 各 纸 片 间 的 距 离 要 大 致 相 等 （ 图 32）。
【材料】
1.菌种：大肠杆菌18～24小时肉汤培养物， 枯草杆菌24～48小时肉汤培养物。
2.培养基：普通琼脂平板。 3.灭菌的三角形纸片、镊子、紫外线灯。
【方法】
1．用接种环沾取大肠杆菌和枯草杆菌培养物 数环，分别在两只琼脂平板培养基表面来回 密密涂满整个平板。
2．以镊子在火焰上迅速通过2～3次杀灭其表 面杂菌后，镊取三角形灭菌纸片两张，各放 一张在每一琼脂平板表面的中央。
（四）滤菌器
c玻质滤菌器
a姜伯朗氏滤菌器 b赛氏（左）和伯克菲尔（右）滤菌器
滤菌器使用时的滤过装置
滤菌器使用时的滤过装置
培养后平板上出现大小不等的抑菌圈
观察记录结果
按表3-1 抑菌环解释标准 来判读细菌 对各种抗生素的敏感度。
四、常用消毒灭菌器与滤菌器
（一）煮沸消毒器： 煮沸消毒器是用金属制成的有盖长方 形锅，锅内有一带孔的盘，底部有电 热装置。
用途：消毒注射器及解剖器械等
煮沸消毒器：
（二）高压蒸汽灭菌器
1．构造：高压蒸汽灭菌器是一个双层的金 属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上 或前方有金属厚盖（见图3-4）。盖旁附 有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢， 因而蒸汽压力升高，随着其温度亦相应的 增高