全长基因的克隆

全长基因的克隆王闵霞　马欣荣　代富英　谭　红(中国科学院成都生物研究所,成都610041)摘　要:新基因全长cDNA序列、全长DNA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。

本文就克隆全长基因的各种技术如文库筛选法、各种PCR技术及新发展起来的电子克隆法等方法作一简单综述。

关键词:全长基因　克隆　文库筛选法　PCR　电子克隆The Cloning of Entire G eneWANG Minxia　MA Xinrong　DAI Fuying　TAN H ong (Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu610041)Abstract:To obtai n the enti re DN A or cDN A sequence of a new gene is a problem f or researchers.The article described the techniques that are used to clone the enti re gene,f or ex am ple:screeni ng li2 braries,a great variety of PCR techniques and new developed silico cloni ng.K ey w ords:enti re gene,cloni ng,screeni ng libraries,PCR techniques,silico cloni ng 研究一个基因的结构、功能及其表达产物的特性,完整的基因信息是必需的,但是新基因全长cD2 NA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。

随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用,对基因进行克隆的技术在原有的基础上也有了许多新的发展,例如差别显示杂交、抑制性差减杂交、RAP2PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cD2 NA直接捕捉法等。

本文就克隆全长基因的各种技术作一简单介绍。

1　文库筛选法文库筛选法是克隆基因最经典的方法,至今仍广泛应用。

构建文库主要有两种类型:基因组文库和cDNA文库。

1.1　从DNA入手,建立基因组文库作为遗传学科研究的重要内容,基因组文库的概念早在七十年代就已提出,Maniatis于1978年设计了随机片段克隆的方案。

选择含有目的基因的基因组DNA,应用物理或酶学方法打断,再选择合适的载体与DNA片段连接,然后转化至受体细胞,培养得到基因组文库。

然后选择合适的方法,如Southern杂交筛选法、HDR(高密度影印膜)杂交筛选或者PCR法等,对基因组文库进行筛选、测序。

Shuichi等使用的两步PCR鉴定技术可在一天内找到所需的克隆。

王瑛等以λ噬菌体EMBL23为基因载体,构建大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)的基因组文库,并从中分离出了全长3361bp的生长激素(cs2 GH)基因的克隆[1]。

然而有时候筛选的结果得到的仅仅是基因片段,这时有必要进行染色体步行以得到基因片段旁边的序列。

染色体步行(Chromosome Walking)是指由基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程[2]。

染色体步行是利用基因库片段的重叠性而设计的。

先根据已知序列制作筛选用的探针,再用杂交法筛选与探针具有相同序列的克隆,此为一步克隆。

根据一步克隆所得的片段末端序列重新设计新的探针,杂交筛选与一步克隆具有重复序列的新克隆,称之为二步克隆。

如此重复进行多次,就能得到完整的基因序列。

虽然现在有基因芯片构建文库,但基因文库的构建与筛选工作量仍然很大,步骤烦琐,而且往往筛选不到目的基因。

而后发展的基因小库有效解决了这个问题。

构建基因小库,需要先将基因组DNA 片段化,然后杂交,从而找到含有目的基因的片段。

回收相应大小的DNA片段,克隆到载体上,获得基因小库。

基因小库的构建使得获得目的基因的概率提高,而且降低了工作量。

张平武等在试探性的Southernblot基础上构建基因小库,从中筛选目的基因,大大减少了筛库的工作量并提高获得目的基因的成功率[3]。

但是如果要克隆的目的基因多于一个,小库的构建往往不能满足要求。

此时基因组文库就显示了它的优势。

值得一提的是,构建文库的载体经历了三个发展阶段,尤其第二阶段的载体容量极大,这对于杂交筛选法一步克隆全长基因提供了更多的可能性。

1.2　从cDNA入手,构建cDNA文库真核基因往往含有内含子和外显子部分,外显子表达产生基因产物。

cDNA就是真核基因的外显子,是与mRNA互补的基因编码部分。

70年代初首例cDNA克隆问世后,选择从cDNA入手,构建cDNA文库成为克隆真核基因的一种常用的方法。

构建cDNA文库需要提取mRNA,进而反转录(R T2PCR)合成cDNA并插入克隆载体,构建cDNA 文库。

近年来发展了一系列建立全长cDNA文库的方法,如1994年Maruyama等建立的oligo2capping 法[4]和CLON TECH公司推出的Cap Finder (SMAR T TM)[5]等均可以得到含有大量全长cDNA 序列的文库。

用核酸、抗体探针筛选cDNA文库是早期寻找基因的主要手段,也是目前克隆功能相关基因的常用方法。

如果杂交、筛选或其他办法筛选的cDNA 片段不是基因全长序列,可以用3’RACR及5’RACE法得到基因全长。

RACE(Papid Amplifica2 tion of cDNA Ends,cDNA末端快速扩增技术)由Frohman1988年首次报道[6],是一种从低丰度转录本中快速扩增cDNA5’和3’末端简单而有效的方法。

RACE是基于PCR技术由已知的部分cDNA 顺序来获得完整cDNA5’和3’端的方法。

该方法也被称为锚定PCR(Anchored PCR)[7]和单边PCR (One2sided PCR)[8]。

详见后锚定PCR部分。

改良和优化了的RACE被广泛地应用于克隆全长cD2 NA。

2　使用PCR技术扩增目的基因的全长基因 PCR技术由美国Centus公司的Mullis首创,是一种体外迅速扩增基因的方法,类似于DNA的体内复制过程。

PCR技术使得获得大量目的基因克隆变得相对容易。

自1985年Mullis[9]首创PCR技术以来,各国科研工作者根据需要,对PCR技术进行改进、完善和发展,极大地提高了分离克隆目的基因的效率。

如果目的基因较长,普通的PCR方法很难一次性获得全长基因,长距离PCR的应用有效的解决了这一问题。

然而,因为目的基因背景知识的限制,一般可以通过普通PCR方法获得基因的部分保守序列,就需要在此基础上通过染色体步行获得基因全长。

反向PCR、锅饼PCR(Panhandle PCR)、Vectorette PCR、连接介导PCR(ligation mediated PCR)和捕获/寡盒介导PCR(Capture/Oligocassette mediated PCR)等就是建立在PCR技术基础上的染色体步行技术,为扩增已知序列旁侧的未知DNA 片段提供了捷径。

这些方法的建立可以不必经过烦琐的建库和筛选过程而获得全长基因序列。

2.1　长距离PCR技术(Long PCR)长PCR(Long PCR)对于克隆全长基因具有重要的意义,但它要求对目的基因了解较多,或者知道基因的两末端序列。

长PCR是指能扩增长度达5 kb以上的DNA片段的PCR技术[24]。

常规PCR只能扩增数百个至上千个碱基的DNA片段,这在许多研究中是不够的,于是长片段DNA的PCR法便应运而生。

最初,有人选择不同的耐热DNA聚合酶,改进缓冲液成分及循环条件等,可以扩增长10～15kb的片段,但产量极低。

直到1994年Barnes 和Cheng等解决了DNA合成中碱基错配现象和模板DNA损伤两个问题才正式建立了长PCR技术。

它可使PCR扩增λ噬菌体长达42kb,扩增复杂的人类基因组达22kb。

长PCR的建立引起了人们的普遍关注,因为它不仅能扩增出DNA片段,更重要的是可利用长PCR来研究分析更长的基因片段,甚至在合适的引物基础上可以一步扩增出较长的全长基因。

2.2　反向PCR(Inverse PCR,IPCR)反向PCR是扩增一段已知顺序的旁侧序列时常用的一种技术。

常规PCR技术是扩增两个引物之间的DNA片段,而反向PCR是用反链的互补引物来扩增两引物之外的DNA片段。

此法所选择的引物虽与已知DNA序列互补,但两引物3’端是反向的。

反向PCR扩增前,先用限制性内切酶酶解DNA,然后用连接酶使带有粘性末端的靶片段自身环化,最后用一对反向引物进行PCR,得到的线性DNA将含有两引物外侧的未知序列。

早期的反向PCR只能扩增几百上千的短片段,后来由于LA聚合酶的应用,反向PCR也可以获得长至几千的片段。

Trilia T等于1988年建立了反向PCR技术,并通过反向PCR技术成功克隆E・Coli中一个插入序列的上游及下游序列[10]。

反向PCR的缺点是环化反应难以控制、线状串联体成为副产物甚至是主要产物,这导致非特异性扩增,如果酶切片段太长也会使扩增效率下降。

李竹红[11]等人于1999年对传统的反向PCR 技术进行了一些改进:用巢式PCR扩增含量极少的靶序列,然后在PCR反应体系中加入5%的甲酰胺以减少非特异性扩增。

实验结果表明,改进的反向PCR技术可以高度灵敏、高度特异地克隆基因组已知片段旁侧的序列。

2.3　锅饼PCR(Panhandle PCR,P2PCR)[12])P2PCR是除反向PCR外,另一种环状PCR技术,因其以一个类似锅饼结构的DNA分子为模板,所以称为锅饼PCR,可以扩增229kb的大片段未知序列。

基因组DNA用限制性内切酶作用成片段,在片段末端连接上含有3’自由端的单链寡核苷酸链(3’自由端与已知序列中部分片段完全反向互补),含有连接片段的单链DNA在合适的温度下自身退火形成一个含有锅饼结构的环,然后用在已知序列内呈线性排列的三个单引物进行三次扩增。

Douglas H.Jons通过P2PCR获得了囊性纤维化跨膜传导调节蛋白5’端长657bp的片段。

2.4　锚定PCR(Anchored PCR)锚定PCR(Anchored PCR)是Loh[13]等设计的一种用于扩增cDNA序列的技术,在一条未知或可变的DNA末端加上一个已知的“尾巴”,再通过扩增进行鉴定的PCR法。

先设计特异的PCR扩增引物,通过单侧特异引物搭配锚定引物,在低严谨条件下扩增各种组织的cDNA分子库以富集目标片段;再以单向锚定PCR扩增产物为模板,用双侧特异引物再次扩增,获得特异PCR产物。