分子生物学

湖南农业大学课程论文

学院：动物科学技术学院班级：动营

姓名：王桂超学号：200940511105 课程论文题目：PCR在当代各个领域的应用

课程名称：分子生物学

评阅成绩：

评阅意见：

成绩评定教师签名：

日期：年月日

PCR在当代各个领域的应用

学生：王桂超

（动科院动营班，学号：200940511105）

摘要：现代生物技术PCR是一种体外特定核酸序列扩增技术，它已经分子生物学、医学、法学、生物化学等多个领域得到了广泛应用。

关键词：医学、畜牧业、动检、食品安全、法学、非生物学方面

（导入语）现代生物技术PCR( 聚合酶链式反应Polymerase chain reactiom ) 是一种体外特定核酸序列扩增技术,在很大程度上代替了传统的DNA克隆方法,利用该技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的序列,使某一DNA 片段得到特异性的扩增.PCR 是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下, 依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应,双链DNA的高温变性、引物与模板的低温退火和适温下引物延伸三个步聚反复循环,每一循环中所合成的新链又都可以作为下一循环的模板.PCR 的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加,达到迅速大量扩增的目的.PCR 整个反应只需经过几个简单的温度变换即可在短时间于试管内完成,目前国内外已有多种PCR 扩增仪,可自动化完成PCR整个反应过程.PCR技术已在分子生物学、医学、法学、生物化学等领域得到了广泛应用。

一、PCR在医学领域的应用

（一、）病原体的检测

由于PCR操作自动化,其敏感性和特异性都优于传统的生物测定法和免疫测定法, 尤其对那些难于培养的病原体及受染细胞很少的潜伏病毒感染,该技术的应用更有意义.国内已有乙型肝类病毒、丙肝病毒、结核杆菌等PCR诊断试剂盒生产、出售.PCR 诊断时,一般可选择病原体基因中的保守区作为靶基因,但也可选择同一病原体基因中变异较大的部份做靶基因,以进行分型检测.

（二）、基因病诊断

PCR技术在基因疾病诊断上的应用主要通过:［1］对扩增产物用打点杂交或限制性内切核酸酶酶解方法确定已知的点突变.对扩增产物直接测序可发现已知或未知突变.通过对用特定引物所获得的不同大小扩增产物进行分析,或未能进行

特异性扩增以发现异常缺失.对DNA多态性连锁分析,间接诊断致病突变.

（三）肿瘤研究

主要用于肿瘤细胞的染色体异常研究,体细胞中肿瘤基因和肿瘤抑制基因突变的研究及用于检测RNA或DNA肿瘤病毒.

二、PCR在畜牧业领域的应用

王群等[2]采用TaqMan探针检测鸡γ干扰素。朱燕等[3]采用RT-FQ-PCR证明中国黄牛背最长肌中capnl mRNA表达量与宰后3 d的牛肉嫩度高度相关。韩彩霞等[4]建立了绵阳PrP基因RT-FQ-PCR检测方法。朱海等[5]所建立的FQ-PCR对生果蔬菜中的大肠埃希菌O157：H7的检测，比传统分离培养法更灵敏，可缩短试验时间。还发现脱脂奶粉和BSA可用于改善生果蔬菜中大肠埃希氏菌O157：H7的FQ-PCR检测体系，提高检测率和检测灵敏度。张明辉等[6]采用TaqMan和SYBR

GreenI作探针，对大豆深加工产品中RR大豆的含量和5种未知大豆深加工样品检测，结果表明，两种方法均可用于转基因深加工产品的检测。

三、PCR在动检领域的应用

近年来，牛海绵状脑病、绵羊痒疫已被证实与人的克雅氏并有直接的关系。FQ-PCR可对动物源性饲料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量检测。国际上严格禁用肉骨粉作所有牲畜的饲料用途，动物源性食品、某些日用消费品的安全性也受到关注，其中以检测DNA为基础的方法在应用中最为广泛FQ-PCR可使检测变得更加简便和精确。徐淑菲[6]等人利用SYBR Green I实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病（ISAV）。根据鲑鱼传染性贫血病毒Y10404的序列合成部分基因片段，将其插入到T载体中，构建阳性质控品，并设计合成一对特异性引物，对反应体系进行优化，进行特异性和敏感性分析，并制作标准曲线，其Tm值为82.5℃，r2 >0.99。所建立的SYBR Green I实时荧光PCR方法能够简单、快速和特异地检出ISAV；最低检出浓度为9.5×10-8 μg/μL, 其灵敏度比传统PCR 高1 000倍，能够从阳性样品中检出ISAV，从而给我国的水产品检疫工作带来极大的便利。

四、PCR在食品安全领域的应用

食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一。据国家食源性疾病监测网的统计资料显示近十年来由微生物引起的食源性疾病事件和涉及人数最多,其中又以副溶血性弧菌(V ibrio parahem oly ticus) 、沙门菌(Salm onella) 、大肠杆菌( Escherichia coli)等病原细菌为主要的病原物质[7]。因此,快速的检测与鉴定食品中病原细菌是及时有效控制与预防病原细菌传播、预防食物中毒的重要前提。传统的细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程,操作复杂、耗时费力,而且无法对人工难以培养的病原细菌进行检测[8,9]。随着现代免疫学和分子生物学理论和技术的不断发展,乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定等免疫学技术、核酸探针技术和PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速等优点已广泛应用于食品病原细菌的检测中[8,10]。但这些方法都存在一个问题:即一次实验只能检测一种病原细菌,而食品样品中往往存在的病原细菌种类很多,有可能涉及不同种和型别的细菌。因此近年来出现了一些一次实验能同时检测多种病原细菌的检测方法,多重PCR (Multip lex PCR)就是其中一种[10]。多重PCR是在常规PCR 基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术,是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段的方法,采用这一技术可同时检测多种病原微生物。该技术自1988年Chamberlain首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来,已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。本文对多重PCR技术在食品病原细菌检测中的应用进展进行了综述。

五、PCR在其他领域的应用

(一)、法学鉴定

目前通过PCR 技术已成功地检测了各种生物材料的DNA, 它们包括头发、精液、血迹、尿液、骨片、唾液和福尔马林固定、石蜡包埋的组织等. 对这些犯罪