管碟法测定抗生素效价

管碟法测定抗生素效价（四环素类）

一、目的和要求

1、了解管碟法的原理。

2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。

二、原理

抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

三、实验材料

1、四环素类抗生素的标准品和样品。

2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。

3、培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml LB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。

4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。

5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。

四、实验实施

1、配制标准品溶液

2、配制样品溶液

3、制备菌悬液。

4、制备平板：

（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。

（2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，

迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。

5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。

6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。

7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。

8、用游标卡尺测量抑菌圈直径。

通过测定抗生素效价来判定其质量好坏和有效成分含量的杀菌剂生物测定。

简史福斯特(J．W．Foster，1942)和施密特(W．H．Schmidt，1944)等曾用比浊法和稀释法测定青霉素的效价，因不够精确，现已不使用。阿布拉汉(E．P．Abrahan，1941)首先采用管碟法测定青霉素的效价(见抑菌圈测定法)、戴维斯(B．D．Davis，1945)等进一步发现青霉素浓度对数值与抑菌圈直径成直线函数关系，并发表了效价测定的计算方法。由于管碟法在抗生素效价测定的所有方法中比较精确，现已成为抗生素效价测定的国际标准方法。

效价单位效价是衡量抗菌素抗菌效能的标准，其单位可分为两大类：①稀释单位。牛津大学最早公布牛津单位，即在标准情况下，能在50毫升肉汁培养基内完全抑制金黄色葡萄球菌(牛津标准菌种)生长时，青霉素的最低含量。后来规定将1毫克抗菌素配制成溶液，在一定条件下进行稀释，能抑制某一病菌生长的最高稀释度作为1毫克抗菌素中所具有的单位。例如1毫克制霉素在一定条件下稀释到3600倍，尚能抑制白色念球菌的繁殖，即1毫克含有3600单位。②重量单位。将纯净的抗菌素重量直接作为抗菌效能的标准，即1微克相当于1个单位。例如，纯净的氯霉素1毫克含有1000个单位。由于前一时期青霉素均以稀释单位进行衡量，为避免重新换算数据，1944年国际联盟卫生组织决定，将1个牛津单位相当于0．6微克苄青霉素钠盐所具有的抗菌效能作为1个国际单位，即1毫克苄青霉素钠盐相当于1667个国际单位。

测定步骤用管碟法测定抗菌素效价的步骤是：①制作含菌培养基平面。将融化的培养基冷却到供试菌所能忍受的温度时，加入供试菌，混匀后倒入灭菌的培养皿内，凝固后即成平面。②滴加药液。在平面上放置四个不锈钢制的小圆管(见图)，管高10毫米，内径6毫米，外径8毫米。在第1个管内放入标准抗菌素高浓度的稀释液，第2个管内放入标准抗菌素低浓度的稀释液(一般高浓度为低浓度的2～4倍)；第3和第4个管内分别放入供试抗菌素高浓度和低浓度的稀释液。供试抗菌素药液的浓度应调到与标准药液的浓度大体相当。测定时通常采用五个培养皿。③适温培养一定时间形成抑制菌圈。④计算效价。测得的抑菌圈直径(d)与药剂浓度对数(logc)在一定范围内成直线函数关系，即d=αlogc+β(α，β为常数)。只要所测药剂与标准药剂是同一物质，而且浓度对数与抑菌圈直径所形成的曲线相互平行，就可采用下列公式计算出所测药剂的效价。

式中θ是供试药剂效价与标准药剂效价之比。θ大于1．5或小于0．5时，应改变供试药液的浓度。ΣUH和ΣUL分别为供试药液高浓度和低浓度抑菌圈直径的合计值；ΣSH和ΣSL分别为标准药液高浓度和低浓度抑菌圈直径的合计值；A 为标准和供试药液高浓度与低浓度的比值。

注意事项应注意以下三点。①供试菌：要求对被测定物质有一定敏感性，生长快速，不易被杂菌污染，不易发生变异；容易制成悬浮液，并有一定抗热性。

②培养基：洋菜浓度要适度，一般为1．5%，培养基厚薄对形成抑菌圈大小影响较大，一般在直径9厘米培养皿内注入5毫升含菌培养基为宜。培养基的pH值

应调到供试菌生长所要求的范围内。③培养条件：药剂处理后的培养基平面，要在低温下放置一定时间(一般5℃下4～6小时)，使药剂充分扩散，然后在适温下培养，以形成清晰的抑菌圈。(见彩图28)

杀菌剂抑菌圈测定法从左到右依次为地衣芽孢杆菌对花生青枯病、白菜软腐病、镰刀菌、西瓜枯萎病、黄瓜角斑病、白菜黑腐病的抑菌圈余国运供图

【参考书目】：

化工部上海医药工业研究所《抗菌素工业分析》，化学工业出版社，北京，1960。