致病性大肠埃希氏菌及其检验

枸椽酸盐试验原理及斜面照片
• 枸椽酸盐试验： 某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸 铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养 基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变 为兰色。大肠杆菌阴性,产气杆菌阳性.
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
大肠杆菌：MR + /VP -
• 注〕关于大肠杆菌的ＩＭＶｉＣ反应的说明 • 大肠杆菌ＩＭＶｉＣ试验的模式反应，在一般情 况下应为“＋＋－－”或将“－＋－－”也包括 在内，共代表了绝大多数大肠杆菌（占９９％） 的实际反应结果，因而受到了国际上的广泛承认， 并将其列为大肠杆菌的常规鉴别ＩＭＶｉＣ反应 公式。但个别大肠杆菌的ＩＭＶｉＣ反应，也可 能出现“＋－－－”和“＋＋－＋”等等异常现 象。由于这种异常反应出现的频率极少，没有普 遍性的代表意义，因而在分类鉴别和统计学上， 可以忽略不计。
致病性大肠埃希氏菌的检验
（四）血清学试验 证实试验： 制备O抗原悬液,稀释血清.稀释血清 与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合,做试管 凝集试验. （五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验 1、动物试验 将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种 肉汤管，于36+1℃培养24小时，3000转／分离心 30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一 份加热60℃30分钟，供ST测定用，另一份不加热， 供LT测定用。
一、埃希氏菌属生物学特性
致病性：（1）致病因素 • 侵袭力:大肠杆菌具有抗原和菌毛,抗原有抗吞噬 作用,有抵抗抗体和补体的作用,菌毛能帮助细菌 黏附于黏膜表面.有侵袭力的菌株可以侵犯肠道表 皮层引起炎症. • 内毒素:大肠杆菌细胞壁具有内毒素的活性 • 肠毒素:有两种,不耐热肠毒素(LT),成分可能是蛋 白质,加热65℃经30min即被破坏. LT与霍乱菌肠 毒素作用相似,都是刺激小肠上皮细胞的腺苷环化 酶,使ATP转变为CAMP,促进肠黏膜细胞的分泌功能, 使肠液大量分泌,引起腹泻;耐热肠毒素(ST)无免 疫性,耐热,100℃经10-20min不被破坏,也可使肠 道细胞的CAMP水平升高,引起腹泻.
I-吲哚（indol）试验 色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚 ↑ 吲哚试剂 •
M-甲基红（methyl red）实验 葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 葡萄糖→丙酮酸
甲基红 甲基红
+
V-VP（Voges-Proskauer）试验 葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙酰→红色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖→丙酮酸 × × 乙酰甲基甲醇
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（二）、分离培养 1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种 于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。 2、于36±1℃ 培养18—24小时观察菌落对于污染严重的食品可 直接按划线法接种，不经过增菌过程。不但要注 意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵的 菌落。
EMB平板照片及原理
致病性大肠埃希氏菌及其检验
大肠埃希氏菌,俗称大肠杆菌,是人 类和动物肠道中正常菌群的主要 成员,每克粪便中约含109个.大肠 埃希氏菌随粪便排出后,广泛分布 于自然界.水、牛乳及其他食品一 旦检出大肠埃希氏菌，即意味着 这些物品直接或间接被粪便污染。
• 正常情况下，大肠埃希氏菌不致病，而且还能合 成维生素B和维生素K,生产大肠菌素，对机体有利。 但当机体抵抗力下降或大肠埃希氏菌侵入肠外组 织或器官时，可作为条件致病菌而引起肠道外感 染。有些血清型可引起肠道感染。致病性大肠埃 希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分 为三大类， 1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)， 2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC) 3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC) 近来又提出另外两类 4、出血性大肠埃希氏菌(EHEC) • 5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)
一、埃希氏菌属生物学特性
致病性：（2）所致疾病 • 肠外感染：泌尿系统感染最常见病原菌。还可引 起胆囊炎、肺炎、新生儿或婴儿脑膜炎。 • 腹泻：产毒素大肠杆菌是婴儿及旅游者腹泻的主 要原因；致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要原因； 侵袭型大肠杆菌主要引起较大儿童和成年人腹泻。
一、埃希氏菌属生物学特性
• 原理：伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料，在 此亦作为指示剂。大肠菌群 大肠菌群发酵乳糖造成酸性环 大肠菌群 境时，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美兰 结合（该两种染料即结合成复合物）使大肠菌群 产生带核心的、有金属光泽的深紫色的 深紫色的（龙胆紫 深紫色的 的紫色）阳性菌落，从菌落表面的反射光中还可 看到绿色金属闪光。在伊红美兰平板上的典型菌 落呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润， 常有金属光泽。有的由于被检样品影响，亦呈现 紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为 大肠杆菌，均应注意挑选。
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板 上的特征
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板粘稠 菌落的特征
沙门氏菌麦康凯琼脂平板菌落
不发酵乳糖
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（三）、生化试验 1、选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发 酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于三糖铁(TSI) 或克氏双糖铁琼脂(KI).同时将这些培养物分别接 种蛋白胨水、半固体、尿素琼脂、氰化钾肉汤和 赖氨酸脱羧酶实验培养基。经36℃培养18-24小时。 弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养 物。 2、TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,氰化 钾阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌. TSI底层不产酸或 H2S、氰化钾、尿素有任何一项 为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做 氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。
• 致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热{ST) 和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食 物中毒。引起大肠埃希氏菌中毒的主要是一些动 物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛 和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。 •
• 1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157 型引起的食物中毒，造成9017多人中毒， 10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其 中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。 2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血 性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人 死亡，中毒人数超过2万人。 • 如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败 血症等均可由大肠杆菌引起。
• 血清学特性 大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)， 鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。 1）O抗原 成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也 是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理 2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原， 本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表 示。 2）H抗原 为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原， 无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能 被酒精破坏。H抗原共有64种。
LT与ST的比较
特性
分子量 耐热性 免疫原性
不耐热肠毒素
较大，73000 不耐热 有 耐热 无
耐热肠毒素
较小，1500-5000
B亚单位受体 肠黏膜GM1神经节苷酯
Βιβλιοθήκη Baidu
肠黏膜GM1神经节苷酯
致病机理
活化细胞腺苷酸环化酶，活化细胞鸟苷酸环化酶， 细胞内cAMP含量升高， 细胞内cGMP含量升高， 分泌功能亢进，引起腹 分泌功能亢进，引起腹 泻 泻
大肠杆菌平板菌落照片
一、埃希氏菌属生物学特性
• 生化特性 1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸 产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳 糖； 2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果 不一致; 3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。 4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素;
5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性， V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性 是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典 型大肠埃希氏菌菌。 IMViC试验：如IMViC试验 为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪 便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细 菌中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验，M： 甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼酸盐利用试 验） •
• 在麦康基培养基上培养的大肠埃希杆菌 大肠埃 希杆菌产生粉红色乳糖发酵菌落。麦康基培养基 是肠道细菌的选择培养基，含胆盐、乳糖和pH指 示剂中性红。乳糖发酵菌落产生酸，将指示剂变 红。（麦康基琼脂，18小时，37℃）
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阳性杆菌
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
大肠杆菌革兰氏染色照片
5）在鲜血琼脂平板上生长，有些菌株可见β溶血环。 6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落 7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌， 也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落； 8）在伊红美兰琼脂上形成紫黑色具有金属光泽的菌 落 9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色 •
埃希氏菌在S．S琼脂平板上形成红色菌落
一、埃希氏菌属生物学特性
形态与染色 本属细菌为革兰氏阴性 两端钝圆、中等大小的 无芽孢杆菌，绝大多数 周生鞭毛，能运动，周 身还有菌毛，不产生荚 膜，某些菌株有荚膜。
普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli
一、埃希氏菌属生物学特性
• 培养特性 1)需氧及兼性厌氧菌 2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好， 在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为 37℃，最适pH为7.2-7.4。 3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸 起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小 的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大 肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。 4)在肉汤培养基中生长18-24小时变为均匀浑，而后 底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。 •
• 3）K抗原 • 是细胞外部的荚膜或菌体表面物质，又称包膜抗原。新 分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据K抗原耐热的 敏感性．可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致 病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原， B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强， 可耐受煮沸1小时而不被破坏。， • O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原 和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希 氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111： K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般 不需要进行H抗原的鉴定。
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
• 致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和 国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部 分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。其检 验程序如图5－2。
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（一）、增菌培养 1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养 肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均 质器打碎样品。 2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群 MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小 时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌肉汤 中，42℃增菌培养18小时。
C-枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验
• 利用枸橼酸盐生长 + • 不能利用 •
一、埃希氏菌属生物学特性
• 抵抗力 • 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60 分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。 • • 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低 的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素 等敏感，青霉素对它的作用弱, 易产生耐药菌株.
致病性大肠埃希氏菌的检验
（四）血清学试验 • 假定试验： 从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病 性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒 素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌 O157血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做 阴性报告。当与某一种多价O血清凝集时,再与该 多价血清所包含的单价血清做实验,如与某一种单 价O血清呈现强烈的凝集反应,即为假定实验阳性. 不凝集的培养物可做阴性报告。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板 上的特征
EMB培养基，上为E.coli，下为伤寒杆菌
大肠杆菌在麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）的特征
• 麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）或伊红美兰（ＥＭＢ）琼脂 平板上，置３７°培养１８—２４小时，检查有无疑 似大肠杆菌菌落。大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌 落呈鲜艳的桃红、粉红色.
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板上的特征