彭勇 烟草组织培养实验报告

烟草组织培养 实验报告

单位：华中师大一附中

姓名：彭 勇

完成时间：2016.10.14

烟草组织培养

（彭 勇 华中师大一附中）

一 实验目的

1．熟悉植物组织培养技术的基本原理

2．掌握培养基制备、外植体处理、接种、培养观察等技术方法

3．理解外植体脱分化及再分化过程

二 实验原理

植物体细胞具有细胞全能性。在无菌且光照、温度、营养等培养条件适宜的情况下，离体的植物组织会经过脱分化过程形成愈伤组织，经再分化形成丛芽、生根最终发育成新的幼苗。

三 实验材料、药品及仪器

1．实验材料：脱毒烟草幼苗（川布兰公司提供）

2．实验药品：70%酒精、超纯水、MS培养基试剂盒等（试剂盒包含MS培养基干粉、pH试纸、激素A/B，川布兰公司提供）

3．仪器设备：微波炉、高压蒸汽灭菌锅、光照培养箱、电子天平、pH计、超经工作台、酒精灯等

4．器械及用具：镊子、手术剪、酒精灯、记号笔等

5．玻璃器皿：培养瓶（川布兰公司提供）、量筒、容量瓶、烧杯、培养皿等

四 实验简要过程与操作

1．操作间超净工作台的准备

将组培室操作间、超净工作台、光照培养箱等打扫清理干净，并用70%酒精对超净工作台等设备进行擦拭消毒，然后将操作间和超净工作台的紫外灯和风机打开，消毒30-60min。

2．培养基的制备

按照试剂盒附带说明书称量、溶解培养基干粉并用微波炉煮沸，定容后浓度浓度为42g/L；然后调节pH至6.0。其中用叶片诱导愈伤组织时，1L培养基需添加激素A 2mL、激素B 20μL；愈伤组织诱导丛芽、根的分化，以及用带芽的茎段直接诱导培养幼苗时，则无需添加激素A和B。

3．培养基的分装

将煮沸并定容后的培养基（呈现澄清透明状），冷却至约50℃（不烫手）时分装至培养瓶，每瓶分装约20-30mL，适当拧紧培养瓶盖。

4．器具及培养基的高压蒸汽灭菌

将分装好的培养瓶以及用牛皮纸包好的镊子、手术剪、培养皿等一并放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃加热20min；灭菌完成后取出置于消毒好的超净工作台，待其自然冷却，培养基灭菌后在瓶底有少量铁锈色颗粒沉淀。

5．接种与培养

接种前用70%酒精擦拭双手，点燃酒精灯，在其附近取出灭菌过的器械用具，打开无菌苗瓶，取出无菌苗置于灭菌过的

培养皿中，根据需要对无菌苗材料的叶片、

带芽的茎段等进行剪切处理，最后将处理

好的叶片材料接种在含激素A/B 的培养基

上，带芽的茎段接种在不含激素的MS 培

养基上。注意整个操作过程均应在酒精灯

火焰旁进行以保证无菌，接种时应保证材

料的形态学下端朝下。

将接种好的培养瓶放入光照培养箱，

光照培养箱设置为：光照12h ，黑暗12h ，

温度20℃。

6．观察与记录

实验起止时间：2016 年 9 月2日~2016 年 10 月13 日，观察时间分段大约1周左右。

（1）2016.9.2-2016.9.13（第一周）

9月2日，由于当时购置的试剂盒、培养瓶等材料没有到货，这次利用另一品牌MS 培养基粉配制 MS 培养基（未添加激素），进行第一次外植体接种实验操作，无菌苗材料有限，这次接种了2瓶带芽茎段和3瓶叶片材料，同时保留了部分无菌苗材料。

9月9日，观擦到茎段材料生长变化明显，已长出2片幼叶，而叶片材料没有明显变化。（注：光照培养箱灯光开启时拍照有明显干扰）

在9月9日和13日，先后两次利用川布兰公司的组培试剂盒配制了新的MS 培养基，一部分按说明书添加了激素A 和B，用于叶片材料的接种培养，另一部分未添加激素，用于带芽茎段的接种培养。

（2）-2016.9.18（第二周）

9月2日接种的茎段材料已发育成有数片幼叶的幼苗，同时生根情况良好。 9月2日接种的叶片材料由于没有添加激素诱导，仍然没有明显变化。 9月9、13日接种的叶片材料，可见材料边缘有少量愈伤组织形成，同时材料变得弯曲。

（3）-2016.9.24（第三周）

9月2日接种的茎段材料生长发育状况良好。

9月2日接种的叶片材料由于没有添加激素诱导，仍然没有生长方面的变化，且叶片材料变黄，边缘出现有干枯的现象。

9月9、13日接种的叶片材料，有大量愈伤组织形成，有的愈伤组织有形成

少量的芽；接种的茎段材料，已发展成6片叶的幼苗。

（4）-2016.9.30（第四周）

9月2日接种的茎段材料生长发育状况良好。

9月9、13日接种的叶片材料，全部的愈伤组织都有大量丛芽形成，有部分芽已出现2片叶。

在9月30、10月4、5几天，分批将这些带有丛芽的愈伤组织转接至不含激素的MS 培养基培养。

10月5日观察到在10月30日转接的丛芽已萌发出2至4片叶。

由于实验初期的材料数量极其有限，于9月下旬又从川布兰公司购置了部分烟草无毒苗，并于9月30日取其带芽茎段进行接种培养（当时未拍照），在10月5日观察时发现已萌发出数片叶及少量的根，并且发现茎段材料携带的芽数量越多，萌发得越快。

（5）-2016.9.30（第五、六周）

9月2日接种的茎段材料生长发育状况良好； 9月2日接种的叶片材料（未添加激素诱导），已经完全干枯。

9月30日接种的带芽茎段已完全发育成小的幼苗，且根发育良好，

9月30以及10月、5日转接愈伤组织，有许多丛芽已萌发带叶的小幼苗，有部分已开始生根，未生根的材料其根原基业已形成。

五 实验结果分析与讨论

1．川布兰公司提供的MS 培养基试剂盒使用非常方便，能够很好地提高实验开展的效率，并且培养效果良好，非常适合在高中使用。

2．该MS 培养基在高压蒸汽灭菌时可能会形成少量红褐色沉淀，是否为氧化的铁离子形成还需进一步实验检测，但其并不影响烟草植物组织生长。不同时期配置的培养基颜色略有不同，原因未知。