11临床病原体检测

病毒分离培养与鉴定的结果评价
必须结合流行病学资料、临床表现、标本来源 及病毒种类加以分析。 从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确 诊断。 从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体 不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒、流 感病毒等。反之需相应的临床表现，才有病原 学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。 阴性不能排除病毒感染。
耐青霉素的肺炎链球菌
定义：1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径 <19mm且MIC>2μg/ml应视为耐青霉素 肺炎链球菌（penicillin resistant strepttococcus paeumoni，PRSP）。
临床意义
PRSP对氨苄西林、 氨苄西林/舒巴坦、 头孢克肟、 头孢唑啉的临床治疗疗效很 差，治疗时参考药敏结果选择药物，经 验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头 孢噻肟联合万古霉素用药。
何时不需进行细菌的药敏试验？
若感染的性质不清楚、标本含数种混合生长的 菌或正常菌群，而且这些菌与正在治疗的感染 关系很小时，通常不必作药敏试验，因为其实 验结果可能有误导作用。 若感染是由公认的对高效药物敏感的微生物引 起，就很少需要作药敏试验。
耐药机制
Hale Waihona Puke 整合子 灭活酶和钝化 酶β内酰胺酶 氨基糖苷钝化酶 氯霉素乙酰转移酶 红霉素酯酶
检验申请单的基本内容
The patient’s name and hospital number. Age and sex. Collection date and time. Diagnosis. Exact nature and source of the specimen. Ordering physician. Immunization history and antimicrobial therapy. Objective
aad基因盒：氨基糖苷类 Dfr基因盒:甲氧磺胺嘧啶 cat、aar 、aac 、ere等
耐药机制
药物作用靶位的改变
核糖体的改变 大环内酯、林可霉素 DNA解旋酶、拓扑异构酶的改变 喹诺酮 类 PBP的改变 β内酰胺类 二氢叶酸还原酶的改变 甲氧苄啶
耐药机制
药物泵出系统 生物膜的形成
革兰阴性菌外膜蛋白减少或消 失 革兰阳性菌肽聚糖层阻碍药物 进入 某些细菌外膜上的药物泵出系 统
血液标本的采集
适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血 症的病人。 采血时间：一般在抗生素使用前，于发 热初期或高峰期采血。 24小时内采血2~3 次可提高阳性率。 采血量：血液与培养基的比例为1：10， 一般成人血量10~20ml，婴儿1~5ml。
骨髓采集：1ml 增菌培养基：SPS（聚茴香脑磺酸钠）一 种抗凝剂，可抑制血中杀菌物质，中和 溶菌酶。 注明抗生素使用情况：磺胺（对氨基苯 甲酸）青霉素（青霉素酶或高渗蔗糖） 其他（硫酸镁）
超广谱β-内酰胺酶是由质粒介导的β-内酰 胺酶，可水解青霉素类、头孢菌素和氨 曲南，主要在大肠埃希菌和克雷伯菌属 等肠杆菌科细菌中产生。
临床意义
产ESBL细菌,不论体外药物敏感试验结 果如何, 对青霉素类、头孢菌素类和氨曲 南治疗均无效。
ESBLs试验的“匙扣”现象
CXM和AMC的中间出现一个“凹坑”
血液标本的采集方法
尿标本的采集
无菌采集中段尿 如考虑厌氧菌感染， 采取膀胱穿刺法采集 标本。 排尿困难者考虑导尿 采集标本。
粪便标本采集
自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清 洁容器中送检。 排便困难者，采用直肠拭子采集。 怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接 种或将标本置于碱性蛋白胨或卡-布运送 培养液送检。 传染性腹泻应连续送检3次。
检查方法
直接显微镜检查 病原体抗原与抗体的检测 病原体核酸的检测 病原体的分离培养与鉴定
诊断
初步诊断：通过直接染色镜检和检出特异性抗 原或其他病原体成分，血清学方法检测特异性 IgG和/或IgM抗体，借助分子生物学方法检测 病原体核酸，结合病史、症状、体征，快速做 出初步诊断。 确定诊断：初步诊断的同时，对标本进行病原 体分离、鉴定及药敏试验，并在常规检查基础 上，结合快速检出和鉴定做出判断。
第二节 细菌耐药性检查
抗生素压力
S
R
抗生素
细菌耐药性问题日显突出：谁负责？

人类自身的滥用（医生、病人）
畜牧养殖业的滥用 免疫抑制剂的广泛应用 抗菌药物研制速度相对缓慢
体外抗菌药物敏感试验的目的
何时需进行细菌的药敏试验？
当一细菌是需要抗微生物药治疗的某感染过程 的病原菌，而其敏感性不能从细菌的种属特性 可靠地推知时，就需要进行药敏试验。 当病原菌被认为是属于对常用抗生素能产生耐 药的菌种时，更需进行药敏试验。
病原体抗原与抗体的检测
特异性 IgM可作为感染性疾病的早期诊 断指标，且可区分原发与复发感染。 特异性 IgG，尤其双份血清的滴度呈4倍 或4倍以上升高，考虑病原体感染。 排除交叉抗原的影响，病原体抗原检测 可明确感染的病原体。
病原体分离培养与鉴定目的
明确感染病原体。 为临床提供体外抗微生物药物敏感试验 结果。
病原体核酸的检测
聚合酶链式反应：扩 增病原体微生物特异 的DNA或 RNA片段。 探针杂交法：通过 已知序列的探针与病 原体的核苷酸杂交， 用以了解病原体的有 无。
病原体核酸检测结果评价
是检测病原体微生物最灵敏的方法，但 具有一定的假阳性与假阴性。 阳性只表明存在某种病原体的核酸，是 否正被感染应结合临床具体分析。 适用难或不能分离培养的微生物
呼吸道标本采集
类型：鼻咽拭子、痰和 经气管采集的标本。 上呼吸道存在正常菌 群，在采集标本与结 果分析时应予考虑。
痰标本的采集
采集时间：晨痰，且 在取痰前用清水反复 漱口。 方法： （1）自然咳痰法 （2）气管镜下采集法 （3）气管穿刺法
生殖道标本
男性：无菌采集尿道口分泌 物或前列腺液。 女性：用无菌棉纤采集阴道 或宫颈分泌物。怀疑厌氧菌 感染，应采用阴道后穹隆穿 刺法，并立即接种于厌氧平 板。 疑似梅毒螺旋体感染，直接 从外生殖器硬下疳蘸取渗出 液，置于盖玻片上，立即送 检。
脑脊液
由临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml， 置于无菌容器中立即送检，不能暂时保 存于冰箱中。
胸腹水等穿刺液标本
用无菌注射器抽取可疑标本，分别置于 抗凝与不抗凝无菌容器中立即送检。 怀疑厌氧菌感染，采用床边接种为宜。
脓液及创伤感染分泌物标本
开放性脓肿及脓性分泌物：用无菌棉纤 采取脓液或病灶深部分泌物，置于斯氏 运送培养基送检。 封闭性脓肿：局部消毒后，用注射器抽 取，怀疑厌氧菌感染，应隔绝空气采集。
菌－－药敏方法
测试菌 普通需氧菌和兼性厌氧菌 药敏方法 纸片扩散法(M2-A8)
苛养菌
厌氧菌 稀释法 (M7-A6)
Etest
琼脂稀释法
宏量(2ml) 肉汤稀释法 微量(0.1ml)
－纸片扩散法
试验原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平
板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片
细菌分离培养与鉴定的结果评价
正常人群的无菌体液中检测到细菌，应 考虑细菌为感染的病原体。 存在正常菌群的标本检测到细菌，应结 合细菌的量考虑是否为致病菌。 如临床表现支持感染，但培养阴性，应 考虑为标本不合格、培养不恰当等因素。 直接镜检找到病原体，而培养阴性，应 考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染
药敏试验结果的解释（1）
敏感（susceptible）：表示测试菌能被测 定药物常规剂量给药后在体内达到的血 药浓度所抑制或杀灭。 耐药（resistant）：表示测试菌不能被 测定药物常规剂量给药后在体内达到的 血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。
药敏试验结果的解释（2）
中介 (intermediate) : 该范围作为敏感与 耐药之间的缓冲区，避免由于微小技术 误差影响实验结果。 最低抑菌浓度（MIC）：能够抑制检测 菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为测 定药物对检测菌的最低抑菌浓度。
β-内酰胺酶的检测
β-内酰胺酶：可水解β-内酰胺类抗生素。 临床意义：（1）流感嗜血杆菌、淋病奈 瑟菌以及卡拉莫拉汉菌等阳性，表示对 青霉素、氨苄西林以及阿莫西林耐药。 （2）葡萄球菌属以及肠球菌属等，阳性 表示对青霉素、氨基组青霉素、羧基组 青霉素以及脲基组青霉素耐药。
产超广谱β-内酰胺酶(extend spectum β-lactamase, ESBL)的肠杆菌科细菌
检验科可拒收部分标本
The specimen transport time exceeds 2 hours postcollection and the specimen is not preserved. The specimen was received in a fixative which kill any microorganism present. The specimen has been received for anaerobic culture from a site known to have anaerobes as part of normal flora.
临床病原体检测
南昌大学第二附属医院 胡晓彦
临床病原体检查目的
明确感染是否发生以及病原体的类型。 提供体外抗微生物药物敏感实验的结果。 密切监视烈性传染病与新的传染病的发 生，及时向行政主管部门报告。 配合相关机构进行流行病学调查。
临床病原体检查的基本程序
医生、护士、病人、外勤、检验师：正 确采集运送标本。 检验科：直接镜检、免疫学和分子生物 检测、病原体分离培养鉴定、药敏实 验——报告结果。 医生：明确诊断、合理用药。
标本采集的基本原则
无菌、及时、按照要求、对照、标注清晰
根据病史与临床表现确定标本采集的类型与部位， 尽量采集病变明显部位标本。 在发病的早期或急性期采集标本，最好在抗生素 使用前（如使用过抗生素应在申请单上注明）。 采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖密封、 立即送检。 标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检。
直接显微镜检查的目的与评价 （1）
染色标本目的：了解细菌的形态、染色 性或观察宿主细胞内包涵体。 评价：为临床初步诊断提供依据。如 CSF找到抗酸杆菌，应初步考虑结核分 枝杆菌感染。
直接显微镜检查的目的与评价（2）
不染色标本：用于观 察病原体的大小、形 态与运动等特性。 结果评价：部分病 原体可借此初步诊断， 如暗视野显微镜下见 弹簧状螺旋体，应怀 疑梅毒螺旋体的感染。
耐万古霉素的肠球菌
定义: 对30μg万古霉素纸片抑菌圈直径 ≤19mm， 或MIC≥32μg/ml应视为耐万古 霉素肠球菌（vancomycin resistant enteroccoccus，VRE）。
临床意义
耐万古霉素肠球菌目前尚无有效的治疗 方法，但是对青霉素敏感的VRE可用青 霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素 耐药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁 霉素和庆大霉素。另外氯霉素、红霉素、 四环素（或多西环素、或米诺环素）及 利福平可用于VRE株。
周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内 测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌
圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测试药物的敏感程度，并与
该药对测试菌的MIC呈负相关。
－纸片扩散法
特殊的耐药菌监测的特殊试验
由于细菌存在一种或几种耐药机制，造 成了细菌的多重耐药性。单一的药敏试 验已不能完全表示细菌的耐药性，必须 进行一些特殊的耐药性监测试验。
标本送检
标本要求在30min内送检，否则影响阳性 率。 烈性传染病标本需专人护送 标本4℃保存
检验科可拒收部分标本
The information on the label does not match the information on the requisition. The specimen has been transported at the improper temperature or in improper medium. The quantity of specimen is insufficient for testing . The specimen is leaking or dried.