离子交换高效液相色谱法(HPLC)测定HBA1C

离子交换高效液相色谱法（HPLC）测定HBA1C

目的应用离子交换高效液相色谱法（HPLC）对人全血糖化血红蛋白A1C （HBA1C）的自动化和准确的测定。方法应用D-10糖化血红蛋白台式测定仪测定，EDTA抗凝静脉全血被自动稀释后注入分析柱。仪器测定系统将预先编程设置的由低到高离子浓度的缓冲液注入系统，在这一过程中，血红蛋白经和分析柱中偶联离子结合的程度大小达到分离，处理好的样本自动被注入分析通路，分离的血红蛋白随后在流经光感测量计时，测量其在415nm的光吸收情况，D-10糖化血红蛋白测定系统临床数据处理软件（CDM）将每次分析过程中收集到的数据还原。此间还要经过两个水平的计算。通过微积分计算得出分析结果和分析图谱，面积计算使用了指数模式的高斯对数（EMG），这样计算已经排除了可变部分的血红蛋白A1C和氨基甲酰血红蛋白等干扰成分。D-10糖化血红蛋白测定系统可人全血管中自动吸取样本，随后进行稀释和分析，每个样本3min内可完成测定。结果该法测定线性范围3.9%～18.5%，批内变异系数0.48%～0.81%，小于2%，批间变异系数1.65%～2.35%，小于5%。结论该法简便、快速、精准，适用于临床实验室测HBA1C水平。

标签：HBA1C；离子交换高效液相色谱法；糖尿病；D-10糖化血红蛋白全自动分析仪

糖化血红蛋白即血液中红细胞内的血红蛋白与血糖不可逆结合的产物，是血红蛋白两条β链N端颉氨酸与葡萄糖化合而成，其中以A1C为主。是反映2～3个月血糖水平的指标，在临床上已作为评估长期血糖控制状况的金标准。

根据《中国2型糖尿病防治指南》的建议，在治疗之初至少检测1次/3个月，一旦达到治疗目标可复查1次/6个月。HBA1C已是临床决定是否需要调整治疗的重要依据。

以住由于HBA1C的检测不够标准化，故不推荐用于诊断糖尿病。近年，HBA1C的标准化检测全球不断完善，2011年WHO正式发布”应用糖化血红蛋白诊断糖尿病”的咨询报告，推荐有条件的地方将HBA1C作为糖尿病的辅助诊断手段。《中国糖尿病防治指南》已将HBA1C做为诊断糖尿病的指标之一。

本实验室检测HBA1C采用了IFCC/NGSP双认证HPLC方法，与DCCT曾使用的方法一致。无需患者空腹，可以任意时间采血，且不受短期饮食、运动等生活方式的影响，一些非糖因素影响HBA1C而引起的误差少见，如血红蛋白病。并已很好的应用于临床。

1 资料与方法

1.1设备BIO-RAD公司生产的D-10糖化血红蛋白全自动分析仪。

1.2试剂BIO-RAD公司提供的配套的HBA1C试剂。

1.3样本的收集与保存采静脉血2ml，用EDTA抗凝。室温可稳定3d，2℃～8°C可保存7d。若标本量不足2ml则需取5ul全血+1.5mlWash试剂然后放在带有标本条形码的白色套内。

1.4样本处理将样本轻轻颠倒混匀，放置于专用样品架插入轨道扫描待測。

1.5样本分析当样品管导入仪器后，取样针直接穿透真空采血管的橡胶帽后再升起，让空气进入样品管从而避免管内残存的压力导致吸样不准。取样针吸入一定量的全血样品到进样装置内，在稀释单元进行样本溶血与稀释。稀释好的已经溶血的样品，由高压泵注入离子交换柱。仪器测定系统将预先编程设置的由低到高离子浓度的缓冲液注入系统，在这一过程中，血红蛋白经和分析柱中偶联离子结合的程度大小达到分离，处理好的样本自动被注入分析通路，分离的血红蛋白随后在流经光感测量计时，测量其在415nm的光吸收情况，D-10糖化血红蛋白测定系统临床数据处理软件（CDM）将每次分析过程中收集到的数据还原。此间还要经过两个水平的计算。通过微积分计算得出分析结果和分析图谱，面积计算使用了指数模式的高斯对数（EMG），这样计算已经排除了可变部分的血红蛋白A1C和氨基甲酰血红蛋白等干扰成。这些过程全是仪器自动化执行，每个标本仅需3min。

2 实验与结果

2.1精密度重复性评估是根据NCCLS推荐的典型方法，批内重复性小于2%，批间精密度小于5%，用于分析的质控血清和数据处理符合以上NCCLS规则，见表1。

2.2特殊标本干扰

2.2.1 LA1C LA1C≤4%时，为了确定其干扰程度，选取两组不同标本，一组为正常健康人，一组为糖尿患者，然后样本中均加入葡萄糖使其浓度调整到200～700mg/dl。随后孵育3h以利于生成LA1C后上机测定，见下表，高达4%的LA1C不会影响HBA1C的测定。见表2。

2.2.2高血脂样本选取两组不同标本，一组为正常健康人，一组为糖尿患者，将标本处理使其甘油三酯范围从100～6000mg/dl，然后配制成如下表的不同浓度，等体积加入不同浓度红细胞样本然后上机测定，结果显示高达6000mg/dl的血脂不影响HBA1C的测定。见表3。

2.2.3黄疸样本为了研究黄疸对此仪器测定HBA1C的影响，选取两组不同标本，一组为正常健康人，一组为糖尿患者，在样本中均加入相同浓度的结合胆红素然后上机测定，结果表明结合胆红素高达20mg/dl仍不影响该仪器对HBA1C 的测定。见表4。

2.3参考范围及线性范围BIO-RAD公司D-10糖化血红蛋白全自动分析仪测

定HBA1C的参考范围为4.1%～6.2%，线性范围为3.8%～18.5%。

3 讨论

3.1糖化血红蛋白形成取决于血糖浓度及血糖与红细胞内的血红蛋白的接触时间，其次生成量与血中葡萄糖尝试成正比，其糖化反应过程缓慢且相对不可逆（糖化血红蛋白一旦形成不再解离）。红细胞寿命约为120d，因此糖化血红蛋白的浓度反映测定前1～2个月内受试者血糖水平，而与血糖的短期波动无关，故可作为糖尿病长期控制的良好标准，也是临床决定是否需要调整治疗的重要依据，并作为糖尿病的辅助诊断手段。

3.2影响HBA1C检测结果的因素

3.21药物维生素C、E、大剂量的水杨酸、促红细胞生成素治疗者可使测定结果降低。

3.22血红蛋白的更新异常时对HBA1C的影响任何可以引起红细胞平均寿命增加的因素都会增加HBA1C的浓度且不依赖于血糖的水平，如脾切除后红细胞清除率下降。任何可能缩短红细胞寿命的因素可能使HBA1C降低，如溶血性贫血，因为未成熟红细胞中的血红蛋白和周围葡萄糖结合少，活动性出血会使网织红细胞的生成增加，从而减少红细胞的平均寿命。接受透析治疗的尿素症患者红细胞寿命缩短。

参考文献：

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[5]李顺君，黄文芳，饶绍琴，等.糖化血红蛋白测定方法学评价[J].检验医学与临床，2007，6（5）：85-86.编辑/哈涛