微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展

微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展

酯酶，又称羧酸酯酶，是一类能够对羧酸酯酯键作用的水解酶，可在水分子的参与下，经由水解作用，将酯类切割成酸类与醇类。酯酶普遍存在于动物、植物和微生物中，在水分子的参与下能够催化裂解酯键形成相应的醇和酸。微生物酯酶作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性，利用其水解反应、酯转换以及酯合成反应广泛应用于食品、化工、环保等领域。在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，主要来源是真菌，真菌中主要是青霉、镰孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等l2属，其次是细菌，细菌主要是假单胞菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌等。另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶。

对于微生物的胞外酯酶，发酵液经离心或过滤去除细胞，将上清液用超滤、盐析或有机溶剂沉淀等方法浓缩粗提;胞内酯酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用盐析或有机溶剂沉淀的方法进行粗提，为了获得更高的纯度，再用凝胶过滤或亲和层析等方法进行细分离。

1. 微生物酯酶的常规分离纯化技术

1.1超滤超滤是利用压力或离心力，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化，根据蛋白质分子大小的不同而选择不同分子量的膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，从而使蛋白质得到分离。

1.2盐析法

盐析一般是指溶液中加入无机盐类，蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。一般粗抽提物常用该法进行粗分。

1.3 有机溶剂沉淀法

利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。有机溶剂能降低溶液的介电常数，削弱溶剂分子与蛋白分子间的作用力，从而增加蛋白质分子上带电粒子的相互吸引力，致使蛋白分子聚合沉淀;另有机溶剂溶解于水的同时，能从蛋白质周围的水化层中夺走水分子，破坏水化层，从而使蛋白质沉淀析出。

1.4凝胶层析

混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，溶液中各物质因分子大小不同而被分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，分子量最小的物质能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。凝胶层析是一种快速而简便的分离分析技术，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处，对于高分子物质有很好的分离效果。因此被生物化学、分子生物学、生物工程以及医药学等领域广泛应用。陈宁等利用Sephadex G-25凝胶层析柱和反相柱对核桃蛋白酶解物，获得抗氧化能力最强的多肽序列Ala-Gly-Gly-Ala。张志强等，采用硫酸钠盐析法与凝胶层析法对卵黄进一步纯化，得到纯度为97%的IgY。

1.5亲和层析

蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质被吸附而滞留在层析柱中，没有亲和力的蛋白质不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，从而达到分离提纯的目的，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

2 新颖的分离纯化技术

2.1 膜处理技术

微生物发酵液以横过膜表面的方式通过错流膜，液流清扫膜表面的溶质层，使溶质无法积聚在膜表面处，从而截留微生物细胞和浓缩含酶发酵液，从而达到分离纯化的目的。Sztajer等用毛细管超滤膜纯化Pseudomonas fluorescens脂肪酶，他们比较了2种毛细管超滤膜：内径1.1mm截断相对分子质量为10kDa 的聚丙烯腈和聚砜。对PS而言，仅观察到浓缩效果，适合浓缩酶;而PAN除了浓缩，还除去杂蛋白可应用于初分离。

2.2 免疫亲和纯化技术

免疫亲和纯化技术是一种高效选择性的蛋白质纯化技术。通过一步纯化，纯化倍数可达1 000-10 000。免疫纯化技术大部分是应用单克隆抗体和多克隆抗体，选择性依赖于单克隆抗体对目标蛋白的特异性程度及对杂蛋白的影响。免疫亲和纯化具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原;②不是所有的抗体都适用于免疫亲和纯化，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就很快速而且可靠;③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果;④经过简单的改进，免疫亲和法也可用于纯化针对不同抗原的特异性抗体。Bandmann等在所有突变体的N末端引入IgG结合位点，构建融合蛋白，利用IgG与靶位点特异性结合的免疫方法纯化了E. coli表达的脂肪酶突变体角质酶。

2.3 反胶束萃取技术

反胶束萃取是指当有机溶剂中加入的表面活性剂浓度超过其临界值时，表面活性剂在溶液中形成反胶束，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力，当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白的水溶液接触后，蛋白及其他亲水性的物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白不与有机溶剂接触，从而不会造成失活，实现对蛋白质的萃取。

目前用于反胶束萃取常用的有机溶剂是异辛烷，反胶束萃取的表面活性剂主要是阴离子丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠和阳离子表面活性剂氯化三辛基甲基铵。为了进一步提高反胶束萃取分离的选择性，可在反胶束表面活性剂的烷基上连接对蛋白质具有生物专一性的配基，实现反胶束亲和萃取分离。

3 微生物酯酶的应用研究

微生物酯酶是一种重要的工业生物酶类，涉及到酯合成、内酯合成、酯交换、多肽合成等催化反应，酯酶催化不需要辅酶且具有反应条件温和、方法简便、催化活性高、选择性强、产物易于分离、易于回收等优点，因此广泛应用于食品、化工、环保等领域。

在食品加工过程中，微生物嗜热酯酶的使用，可以减少食品的脂肪水解、蛋白质消化、纤维素水解等过程在常温下用传统酶作用造成的食品污染，同时可以将水解、消化过程与烹制相结合减少工序。