第七章 凝胶层析

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一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构



商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡 聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为 交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
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2 规格型号：

Sephadex G-X ，X数字代表 1）代表交联度
5. 吸水率和床体积


吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量。 但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表 示凝胶装柱后的体积。 而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。
二、凝胶层析的特点



（1）凝胶层析操作简便、设备简单(仅需一根层 析柱) 。 （2）分离效果较好，重复性高，样品回收率高, 接近100%。 （3）分离条件缓和。 （4）应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激 素、
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五、多孔玻璃微球(Bio-glas)


特点：1、化学稳定性高、强度大。 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径, 越大，分离分子量也越大。
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六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物质。 分离不溶水的有机物质。
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2.琼脂糖凝胶特点



1、没有共价键的交联。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、颗粒强度差。 5、非特异性吸附力低。 6、分离范围大。
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琼脂糖凝胶分离范围
琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分 别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。
其中固定的称为固定相；流过固定相的称为流 动相。
3.层析法的分类
根据两相所处状态
气相(气-液;气-固)层析 液相(液-液;液-固)层析
吸附层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 柱层析 纸层析 薄层层析 薄膜层析
根据层析分离机 制
根据操作形式不同
凝胶层析



第一节 凝胶层析的基本原理 第二节 凝胶的结构和性质 第三节 凝胶层析的实验条件和操作 第四节 色谱峰变宽的问题（自学） 第五节 凝胶层析的应用
⑷峰洗脱体积（淋出体积Ve）：是指被分离物质 通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve表示。

Ve=V0+Vi，ace

Vi ，ace 是Vi 的一部分，它与Vi 之比成为Kd （分 配系数） Ve=V0+Vi Kd

2.分配系数Kd
分配系数：


当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。 因此分子的正常Kd值0~1之间,这种由小到大的Kd值 顺序决定了物质流出的顺序。

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1）类分离


（1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。
选 用 Sephadex G-25 凝 胶 ， 分 离 范 围 1 000～5 000。

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2）分级分离


（1）使各种物质的Kd值尽可能相差大。 （2）使组分的分子量尽可能分布在凝胶分 离范围的两侧，或接近两侧的位置。 （3）样品中含有3个组分： 一个接近全排阻 另一个接近全渗入 第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的 3倍，并小于排阻限的1/3。。 如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效 果要比Sephadex G-150为好。


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（二）凝胶粒度的选择

细粒凝胶柱流速低，洗 脱峰窄，分辨率高，用 于精制分离或分析。 粗粒凝胶柱流速高，洗 脱峰平坦，分辨率低， 用于粗制分离，脱盐。

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（三）凝胶的预处理

使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂， 并达到平衡。 干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶涨(水浴)。

第一节 凝胶层析的基本原理


一、凝胶层析原理 凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透 层析等。 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的 组分得以分离的层析方法。
二、凝胶层析的重要参数 1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 ⑴柱体积(VA) ：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝 胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝 胶床，因此柱体积又称“床”体积(VA)。 ⑵外水体积（V0 ） ：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积 称外水体积，亦称间隙体积，常用V0表示。 ⑶内水体积Vi ：因凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空 间，液体可进入颗粒内部，水的总和为内水体积，又称 定相体积，常用Vi表示。 不包括基质的体积（Vg）。 VA=V0+Vi+Vg V柱内空间＝Vo＋Vi
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2.聚丙烯酰胺凝胶的性质
1）孔径大小（可通过交联度调整）； 2）稳定性、强度； 3）无非特异吸附，保存方便； 4）生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如Bio-Gel P-100。
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四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）


（一）琼脂糖凝胶
1.结构 是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3-和 β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
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（二）凝胶柱的装填 常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻 璃等。


支持物要求不漏不堵，不吸附样品，且能保持一定流速

空柱中应留约1/5的水或溶剂. 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和 胶面倾斜。 凝胶悬液浓度适当

以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱” 二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至 今。
2.层析法的基本原理

层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系 数等），使各组分在两相中的分布程度不同，从而使 各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。

第七章 凝胶层析
概述
1.层析法简介
层析法（也称色谱法）：

早在1903年由俄国植物学家Tswett分离植物色 素时采用。

他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒 入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自 由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色 的谱带。这种方法因此得名为色谱法。
蛋白质、多糖、核酸的分离纯化，脱盐、浓缩以及分析测定类。

（5）分辨率不高，分离操作较慢。
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第二节 凝胶的结构和性质



一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
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物质的Kd值
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3. 排阻极限




排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子 的分子量。 所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部， 直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出 来。 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大 于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分 离。 例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
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3.保存



琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不 能再溶胀恢复原有形状，因此商品在都以含水 状态供应，并应在湿态保存。 一般悬浮在10-3mol/L EDTA和0.02%叠氮化钠 溶液中。 避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）

架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。 它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。 对热和化学物质的稳定 性大大增加,在pH3~14 范围内稳定。
葡聚糖凝胶性能与编号的关系
编号
交联 吸液量 度
膨胀 速度
凝胶 孔径
分离限 凝胶 强度
大 （ Sephadex G－150 ）
小 （ Sephadex G－ 50 ）
小
大
慢大大小源自大小快小
小
大
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葡聚糖凝胶（G类）的规格
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3.性质 稳定性。

能被强酸、强碱和氧化剂破坏，对稀酸稀碱和盐溶 液稳定，能耐受一定高温。 含少量羟基：对阳离子轻微吸附 环状结构：对芳香族化合物和杂环化合物出现滞留



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一
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第三节 凝胶层析的实验条 件和操作
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一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
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一、凝胶的选择和处理

（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋 白质与盐类，称作类分离。 (2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
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二、凝胶层析柱的设计和制备

（一）层析柱的选择

1.柱比：层析柱长度与直径的比值称作“柱比”。

对于类分离，柱比5:1到10:1即可。 对于分级分离，柱比在25至100之间。