生物药物的提取纯化技术

五、生物药物生产的屏蔽防护技术 (Containment technology)
一些药物(如抗癌药)往往对生物活细胞具有 毒性，因此必须对中试或大生产的全过程设臵屏 蔽防护装臵。其基本要求是：人员进出口要加以 控制；在工作场所保持负压(一级、二级或三级生 物密封室)；空气的排放必须通过HEPA过滤器；对 有烟雾产生的设备要有附加的屏蔽防护装臵；有 适当的个人防护措施；生产过程中所排放的废物 要有生物学或化学的除污方法；对工作人员进行 医疗监测；环境监测。
(三)膜过滤操作
主要的膜分离过程如下表
微滤器、超滤器和反渗透器 的主要类型有平板式、管式、中 空纤维式和螺旋卷绕式4种。
(四)亲和超滤
1．原理
当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍 地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧 结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结 合，因而结聚在膜的这一侧。不与配基结 合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用 适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来。
三. 离心
可分为离心过滤、离心沉降、离心分离3 种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉 降式离心机和分离机。过滤式离心机可用于 处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场 合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的 固液分离。分离机用于分离两种互不相溶的、 密度有微小差异的乳浊液或含微量固体微粒 的乳浊液。
四、提取纯化的工艺论证
1994年开始了各项GMP验证，其中工艺论证 是一个不可缺少的组成部分。产品的纯化是生 产过程中关键的一步。这涉及到药物的质量。 所谓工艺验证，就是通过系统的方法得到关于 生产工艺的书面材料，证明并保证生产过程能 始终如一地生产出特定的高质量的产品。提取 纯化处理工艺验证的范围包括：厂房设施、工 程仪表、机械设备、生产环境、工艺条件、计 算机软件、介质、原材料、半成品、成品、操 作人员素质和测试方法等。
超滤是在外压作用下进行的，而透析是在 常压下依靠小分子物质的扩散运动来完成的。 透析装臵有：透析袋、旋转透析器、平面透析 器、连续透析器、浅流透析器、微管透析器。
六、泡沫分离
泡沫分离的原理是：将气体通入含多 种组分的溶液中，由于这些组分的表面活 性有差异，因此在溶液的表面，某些组分 将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条 件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多 的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其 含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的 不同组分就得以分离。
第七章 生物药物的提取纯化技术


第一节 概 述 第二节 预处理及固液分离技术 第三节 沉 淀 第四节 萃取(Extraction) 第五节 吸附(Sorption) 第六节 亲和层析 第七节 新型层析分离纯化装置及介质
第一节 概 述
一. 生物药物的特点
生物药物的稳定性受pH、温度、离子强度 、提取过程所使用的溶剂和表面活性剂、金属 离子等方面的影响，生物药物对剪切力也很敏 感，分子量越大，稳定性就越差。因此，在分 离纯化过程中，条件应当越温和。许多生物药 物组分的浓度非常低，但生物药物产品的纯度 却要求很高，含量要达到95％甚至98％以上， 最好是结晶态产品。另外，生物药物还应具有 正常的颜色、稳定性和溶解速率。
2．亲和结合的方式
亲和配基和目标组分的结合方式有 两种：(1)将含有目标物的溶液与配基在 超滤器内混合，或单独在混合槽内混合： (2)将含有目的物的溶液及含有配基的溶 液用泵分别送至膜的两侧，当蛋白质通过 膜到达膜的另一侧(配基所在地)时，与配 基结合。第1种方法较为常用，适应于相 对较清的发酵液，或发酵液预先经过预超 滤。
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纯化工艺的每一步均应测定纯度， 计算提纯倍数和收率等。纯化工艺过 程中应尽量避免加入对人体有害的物 质，若不得不加入，应设法除尽；并 在最终产品中检测残留量，残留量应 远远低于危害剂量，还要考虑到多次 使用的积蓄作用。
第二节 预处理及固液分离技术
一. 直接从发酵液中提取产品
指发酵液不经预处理，或仅通过 简单的预处理。可采用树脂吸附法、柱式流 化床吸附法等。由于可不必先分离菌丝体和 固形物，因而可简化分离过程，提高产品收 率，减少吸附剂的损耗，缩短操作时间。
五. 渗滤(Diafiltration)技术和透 析(Dialysis)
蛋白质和酶粗制品的脱盐的方法除 了离子交换法、凝胶过滤外，还有透析 和渗滤。
渗滤是利用超滤器，选择性地使低分子 量的溶质及水分子通过超滤膜，而保留分子 量较大的溶质。在操作过程中，要不断补充 同体积的去离子水，使原溶液中的产品得到 纯化。其特点是：原溶液的体积保持恒定， 目标物的浓度也保持恒定。
二. 细胞破碎(Cell disruption)
(一)细胞破碎方法分类 可分为两大类：机械破碎和非机械方法破碎。对 液相物料，机械破碎法有超声波、机械搅拌和压力法 。对固相物料，机械破碎法有研磨法和压力法。非机 械破碎法分为脱水(空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和 有机溶剂干燥)和裂解(物理法、化学法和酶法)两类。 裂解法又分为渗透压突变法、冷冻和解冻法等。化学 法有阴阳离子洗涤剂处理法、抗生素处理法和甘氨酸 处理法。酶法可用溶菌酶等有关的酶制剂处理，或用 噬菌体裂解、抗生素处理等。
生物药物提取纯化技术的另一特点是 注重新材料的研制开发，如膜分离介质， 层析介质，亲和配基，新型萃取剂等在最 近几十年来发展非常快。提取纯化设备方 面推陈出新，在设备的计算机控制及生产 自动化、连续化及GMP规范化等方面取得 了很大的成就。
膜过滤技术发展很快，分为微滤、超滤和纳滤， 不仅用于细胞的分离，还用于蛋白质的浓缩。超滤 技术的主要特点是节能，对生物大分子类药物无破 坏作用。液-液萃取广泛应用于抗生素及小分子量药 物的提取。溶剂选择的余地大，且易实现大规模生 产。高速离心式液体萃取机是目前效率最高，使用 最广的装臵。液-液萃取技术还衍生出许多新的萃取 技术，如双水相萃取，亲和萃取，超临界萃取等。 双水相萃取蛋白质类药物是大规模提取高纯度蛋白 质类药物的有效技术。而超临界萃取利用超临界流 体的物理特性，即通过压力和温度的改变控制溶质 在溶剂中的分子扩散能力，控制溶质的溶解度，从 而实现分离。
离心技术在生物制药研究及生产中 应用极广，如从培养液中分离收集细胞， 去除细胞碎片，收集沉淀物，从含蛋白 质的液体中除去蛋白质吸附剂，也包括 用超速离心法分离溶解的大分子。
四、膜分离技术
(一)膜分离原理及特点
膜分离的基本原理是：膜作为一种有选择性 的障碍物，允许某些组分通过，而不许其他组分 通过，因此将料液分成透过液和保留液两部分。 膜分离技术在分离物质过程中不涉及相变，无二 次污染。可分批操作，也可连续操作，易于自动 化和扩大生产规模，分离效率较高。膜分离的缺 点是膜易污染，使膜的性能降低。合成材料制成 的膜在耐热、耐化学腐蚀等方面尚需改进，膜分 离技术需要与其他分离技术结合起来使用。
根据主要分离因素排列的单元操作分离范围见表7-1。
三、提取纯化单元操作技术的特点
分离纯化技术的特点之一是各种技术 相互交叉，新型的分离纯化方法不断涌现。 如沉淀技术和亲和技术相结合，形成了亲 和沉淀技术；超滤和亲和技术相结合，形 成了亲和超滤技术；萃取与载体膜相结合， 形成了液膜载体萃取法。这些新方法取长 补短，使分离纯化过程更加科学合理、快 速有效、经济实用。
六、纯化工艺过程的质量控制
生物药物纯化工艺技术要求高，应 尽可能选用高质量的设备，并要求有清洁 的各级GMP厂房。纯化方法的设计应考虑 到尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞 杂蛋白、糖及其他杂质，要防止纯化过程 中带入有害物质。
关于纯度的要求，可视产品的来 源、用途和用法而制定，例如经反复 多次使用的真核细胞表达的制品，要 求纯度达到98％以上；多次使用的原 核细胞表达的制品要达95％以上；外 用制品的纯度可降低要求。
按照膜的结构分为对称性膜、不对称膜和复 合膜。
用于生物制药工业中的膜材料要求耐温性能 要好、耐酸碱处理、有较好的生物相容性（即要 求膜对蛋白质和酶等生物大分子不产生变性，无 抗原性）。
按照膜的材料可分为合成聚合物膜、 无机材料膜和不锈钢膜。如常用的微滤膜 材料有醋酸纤维酯和硝酸纤维酯、再生纤 维素和聚四氟乙烯等，超滤膜材料有聚砜、 聚醚砜、聚偏二氟乙烯、硝酸纤维酯(或 醋酸纤维酯)、尼龙、丙烯腈-氯乙烯共聚 物膜。此外还有不锈钢膜。
二、提取纯化的单元操作和基本工艺流程
生物药物的提取和纯化可分为5个主要 步骤：预处理、固液分离、浓缩、纯化和 产品定型(干燥，制丸，挤压，造粒，制 片)。每一步骤都可采用各种单元操作。在 提取纯化过程中，要尽可能减少操作步骤， 因为每一操作步骤都不可避免带来损失。 生物药物提取工艺流程的基本模式如图7-1 所示。
以上各个部分都要有验证材料或试验数据， 根据这些材料和数据写出验证报告。当工艺的某 一部分有较大变动 (大修、工艺条件变化)时，要 进行重新验证（再验证）。再验证是针对某一部 分的行动，而不是整个工艺过程的验证，因此比 较简单、快速、易行。验证的实施过程包括以下 步骤：提出验证要求、组织验证小组、制定验证 方案、实施验证试验、写出验证报告和再验证。
高效液相色谱法本是分析化学的常用手段，现 已将其扩展到生物药物的分离纯化的应用中。有些 设备不仅可进行分析，也可进行分离纯化，在新药 开发的过程中，缩短了分离纯化所需时间。与层析 技术同步发展的各种分离介质是层析分离的技术保 障，商品化的预装柱、缓冲剂、计算机程序控制使 操作变得简单易学。臵换层析与洗脱层析不同，是 指吸附在层析柱上的一种组分被另一种臵换剂(与层 析上的介质的亲和力大于原被吸附的组分)臵换出来 的层析技术。该技术有上样量高，分辨率高的特点。 被分离的样品在分离过程中还有浓缩作用。总之， 随着科技的发展，新的分离、提取、纯化技术将不 断得到改进。
泡沫分离法的特点是分离所用的机械结构 简单，可连续操作，容易放大，费用也不高。
泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富 集率(泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质 的浓度)，另一方面提高酶蛋白的提取率(泡沫 中蛋白质的质量/最初的蛋白质质量)，或使多 组分混合物中某一组分的分配系数最大。 在泡沫分离过程中，要选择好操作条件， 以保持酶蛋白的天然结构不变，活力不降低。
(二)破碎技术(微生物细胞破碎)
高压均质器法：是当前较为理想的大规模破碎细 胞的方法。可破碎酵母菌、大肠杆菌、假单胞菌、杆 菌，甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个 孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境， 细胞就容易破碎。高压均质器的操作参数较简单，主 要是操作压力、温度以及通过高压均质器的次数。但 机理却颇为复杂。 工业上所用的高压均质器的操作压力一般为 55MPa，菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12 ％～67％。细胞破碎率与细胞的种类有关。
层析(色谱)技术是最近几十年来发展最快的纯 化技术。层析装臵的种类很多，且分离纯化机理也 各不相同，适应于许多药物产品的分离纯化。离子 交换色谱是应用最广，且易于实现大规模生产的方 法。应用于抗生素、氨基酸、核苷酸、蛋白质的提 取和纯化。分子筛层析根据分子量大小不同的原理， 适应于蛋白质类药物的纯化。层析分离技术的最高 层次当属基于分子识别的技术，如亲和层析。这一 技术已衍生出一大批新的技术，如免疫亲和层析、 染料亲和层析、金属离子螯合层析。疏水性层析是 基于分子的疏水性能来分离纯化的。
决定超滤亲和纯化效率及质量的主 要因素是：目的物的代表性分子量、大 分子配基及超滤膜的截留分子产量。超 滤膜的孔径应适宜，并要求分布均匀， 以防止漏出配基。要便于蛋白质及杂质 的自由通过。大分子配基吸附到膜上， 会降低过滤速度，有的配基还会沉淀到 膜的表面。在膜的表面引入电荷可以防 止这种情况的发生。
(二)膜分离材料及装臵
膜可以是完全可透的，也可以是半透性的； 有的膜是独立存在于流体间的，也有的膜是附着 于支撑物或载体上的微孔隙中。膜还必须具有高 度的渗透选择性。 按照膜的孔径大小，可将膜分为：微滤膜 (0.025～14 m)；超滤膜 (0.001～0.02 m)； 反渗透膜0.000l～0.001m)；纳米膜(平均直径 2 nm)。