钠泵的研究进展

钠泵的研究进展
徐俊
（武汉工业学院动物科学与营养工程学院）
摘要：在细胞膜上汲引钠的分子机构比喻为泵，故称钠泵（sodium pump），是R．B．Dean （1941）首先使用钠泵这个词，但在细胞膜上作为刺激传递机构的泵被假定存在以后（A．L．Hodgkin等，1949），此词已被广泛使用。

现在已经明确钠泵的实质是钠-钾ATP酶。

随着现代科学技术的飞速发展，对钠泵的研究也有长足的进展，更清晰地了解了钠泵的分子结构和生化生理作用。

关键词：钠泵；生化生理
1.引言
钠泵是镶嵌在细胞膜磷脂双份子层之间的一种特殊蛋白质，它是一种大分子蛋白，具有ATP酶的活性，当细胞内Na+增加或细胞膜外K+增加时被激活，因此又称钠-钾依赖式ATP 酶。

早在上世纪 50 年代，人们就在枪乌鲗巨大神经轴突细胞膜上证实了主动转运过程的存在，并称之为钠泵（sodium pump）。

当时在实验中把 22 Na +或 24 Na +通过微电极注入轴浆后，可测量到一个恒定的放射活性的外向电流，从而直接证实了 Na + 逆浓度梯度的跨膜转运。

实验还证实这一转运过程必须在细胞外K+存在时才能发生，表明 Na+的外排与 K +的内入相耦联，并计算出耦联的比例是 3Na +: 2K +: 1ATP ，因此钠泵也称为钠 - 钾泵。

此外还证明，钠泵可被强心苷特异性抑制，这是它的一个重要特征。

1957 年，丹麦的 Skou 在蟹的外周神经膜上分离出一种 ATP 酶，这种酶的不寻常之处是它在同时存在 Na +和 K + 的条件下被激活，这与细胞内被 K +激活的酶通常被 Na + 所抑制规律的不同。

此外，此酶的活性还可被强心苷抑制。

根据这些结果，他提出这种 Na+, K+ -ATP 酶就是钠泵的设想，并在以后的大量实验中得到证实。

Skou 也因此获得 1997 年诺贝尔化学奖。

2.钠泵的生理意义
钠泵使得每次动作电位之后膜内外Na和K的浓度差正常，是细胞具有兴奋性的基础；钠泵活动所贮备的能量也可以完成其他的生理活动，例如小肠上皮细胞对葡萄糖的继发性主动转运；钠泵造成的细胞内高K是某些代谢反应的基础，同时可以防止Na大量进入细胞内，使细胞结构和功能遭到破坏。

3.研究简史
细胞膜钠钾泵作用首先是由Hodkin和Keynes（1955）所发现。

1957年Skou发现了钠-钾 ATP酶并证明其与钠钾泵的作用有关。

Dost （ 1969 ）和 Albers （ 1967 ）提出双构象机制，也称为 Post-Albers 模型（ Post-Albers scheme ），它得到后来许多实验的支持。

例如，在对酶进行水解的实验中证实，当 Na +存在时，钠钾-ATP 酶暴露出被胰蛋白酶水解的 T2 、 T3 位点和被糜蛋白
酶水解的 C3 位点，而在 K+存在时， T2 仍是裂解位点，但 T3 和 C3 被隐藏了，同时又增加了一个 T1 酶解位点。

近年来生物化学和光谱学的资料进一步显示，α亚基 E 1 /E 2 构象的相互转化介导了胞质结构域与跨膜肽段内阳离子结合位点的相互作用，并使酶的 ATP 结合、磷酸化和去磷酸化过程与 3Na +外排和 2K + 内入相耦联。

1970 年 Vassalle利用超速刺激驱动心室 Purkinje 纤维，使自发活动的 Purkinje 纤维出现超级化。

使用特异性钠泵抑制剂哇巴因可阻止超级化的发生。

利用膜片钳技术测量钠泵电流，成为研究钠泵活动特性及其影响因素的常用方法。

4.现代研究进展
在钠泵的分子结构上，目前利用分子生物学技术对 a 亚基的结构、功能关系作了大量的研究。

根据疏水性测定和抗体表位定位研究推断，α亚基包括 10 个跨膜α螺旋，即H1-H10 ， N 端和 C 端都位于胞质侧，在 H4-H5 之间有一个很大的胞内环，上面有 ATP 结合位点和磷酸化位点，分别位于 K501 和 D369 。

点突变的研究证明，结合并转运 Na+、K+的位点不局限于个别的氨基酸残基，而是由许多残基构成的结合小袋（ binding pocket ），位于包括 S775 、 E779 、 D804 和 D808 等关键残基的 H5-H6 区。

一般认为，这一结构域在酶分子构象改变时发生移动，造成离子转运，有如电压门控通道分子中带电的S4 跨膜段在通道激活过程中所起的作用。

酶分子中强心苷的结合袋位于 H1 跨膜段和H1-H2 之间的胞外环，包括 C104 、 Y108 、 Q111 、 D121 、 N122 等关键的氨基酸残基。

在钠泵生化生理作用及其影响因素上，也有长足的进展：
2010年，范维乾、张玉录(北京东四中医医院)，孙砚霞(北京东四中医医院)著《中医说钠泵——驳973计划的错误观点》文中指出中医学是人体的社会科学,目的是研究人体宏观的问题,但宏观建立在微观的基础上,涵盖分子细胞。

中医中有藏象理论，本文通过钠泵这个蛋白质分子，阐释了藏象理论不仅能够在分子细胞领域畅行无阻，而且表明中医学的先进性、科学性居于当今领先水平，是未来人类医学人体科学的发展方向。

2010年，刘志文、张玥、王永利、赵兴茹、崔京霞 (河北医科大学,药学院药剂教研室)，连易水、王伟 (河北医科大学,基础医学院药理教研室)著《人钠泵α2亚基M4～M5区片段的克隆、原核表达与纯化》该研究是为了构建钠泵α2亚基第4跨膜区与第5跨膜区之间的蛋白结构域M4～M5的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。

该研究通过PCR 反应和酶切技术,构建表达载体,并于大肠杆菌E.coli Rosetta 2进行表达,用6 mol/L盐酸胍对表达形成的不溶包涵体进行变性,梯度稀释复性后,用Ni-NTA亲和柱进行纯化,得到目的蛋白,用Western blot分析表达产物,并采用无机磷法测定其ATP酶活性。

结果表明重组表达载体经酶切与测序鉴定，证实了其构建成功。

本研究最终构建了原核表达载体并在大肠杆菌Rosetta 2中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的M4～M5融合蛋白。

2009年，张明娟、杨军、朱参战、段宗明、牛小麟、王蓉、宋雅燔 (西安交通大学医学院第二附属医院,心内科)著《In-fusion技术构建表达、纯化钠泵α3亚单位膜外区截断性片段重组质粒》该研究构建重组了pGEX-6P-1原核表达载体,表达和纯化了大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区的截断性片段。

该研究利用In-fusion技术将钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区基因片段插入线性化的pGEX-6P-1载体中,转化,提取质粒,PCR 鉴定；用阳性重组质粒pGEX-Trf-α3转化大肠杆菌,IPTG诱导、表达融合蛋白GST-Trf-α3。

采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白, SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性及含量.采用放射性配体结合法检测其生物活性。

结果 PCR和基因测序分析显示大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区被成功插入pGEX-6P-1载体GST基因3′端。

该研究
采用In-fusion技术成功构建了表达GST-Trf-α3融合蛋白的原核表达载体,建立了纯化方法 ,获得高纯度的融合蛋白,为钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区功能以及其潜在的药理学作用研究获得了实验数据。

2008年，刘红 (川北医学院)，罗蕾、高原(遵义医学院珠海校区)著《大鼠脑穹窿下器官微量注射AngⅡ对肾近球小管Na+,K+-ATPase功能的影响》该研究探讨了大鼠穹窿下器官(SFO)对外周肾小管钠泵的调节作用及机制。

研究结果表明大鼠SFO注射AngⅡ后,肾近球小管钠泵活性将下降,原因可能与SFO注射AngⅡ后,激动SFO的AT1受体,直接或间接升高血清EDLS水平有关。

2008年，王娜、徐瑞成、陈小义、呼文亮 (中国人民武装警察部队医学院细胞生物学教研室)著《哇巴因对人血管内皮细胞死亡和钠泵α1、β1,亚单位表达的影响》该试验研究了钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)对人血管内皮细胞死亡的影响及其作用机制。

试验以脐静脉内皮细胞系ECV304为靶细胞,应用MTT实验检测哇巴因对细胞生长的作用。

采用Hoechst33342/PI双荧光染色、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析细胞死亡特征,半定量RT-PCR法检测钠泵α1和β1亚单位mRNA的表达。

结果表明哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长。

10μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死。

0.1μmol/L 哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、分布于核膜内缘、DNA裂解等凋亡特征。

哇巴因能明显上调ECV304细胞钠泵α1亚单位mRNA的表达,下调β1亚单位mRNA表达,且两者均呈时间依赖性。

哇巴因能诱导人血管内皮细胞ECV304死亡,其上调钠泵α1亚单位表达、下调β1亚单位表达,可能与亚单位介导信号传递、降低细胞黏附有关。

2008年，张明娟、杨军、强磊、王蓉、宋亚燔、牛小麟 (西安交通大学医学院第二附属医院心内科)著《大鼠钠泵α2亚单位M1～M2膜外区多肽体外活性鉴定》该试验研究了大鼠钠泵α2亚单位M1～M2膜外区的多肽片段(peptide contmning rat sodium pump α2 subunit M1-M21extramembrane fragment,RES2衍生物)是否具有与内源性钠泵抑制因子结合以及改善钠泵α亚单位活性的作用。

结果显示,RES2衍生物与3H-哇巴因具有一定的结合能力,其平衡解离常数(Kd)为38.46 nmol/L,IC50为6.353nmol/L.RES2衍生物可以阻断哇巴因对红细胞膜Na+,K+-ATPase的抑制作用,使红细胞86Rb摄取率从38.53%上升到83.69%左右,并呈一定的剂量依赖关系。

因此,RES2衍生物不仅具有体外结合活性,而且具有改善钠泵活性的生物学效应,为其成为有效的抗高血压药物提供科学依据。

2008年，罗蕾 (遵义医学院生理学教研室)，刘红 (川北医学院生理学教研室)，余德芊 (遵义医学院生理学教研室)，刘爱东、高原 (遵义医学院珠海校区生理学教研室)著《大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法》该试验以Doucet介绍的方法为基础,改良了测定大鼠肾脏近端小管Na+-K+-ATPase活性的方法。

改良的方法与Doucet建立的经典方法比较，测定结果无显著性差异(P<0.05)，但对小管长度确定平均耗时和转移含32P的孵育液平均耗时明显降低。

改良的方法减少了操作步骤,缩短了操作时间和暴露在放射性环境中的时间，简化并改进了操作条件,降低了实验要求和成本。

2007年，杨礼富(中国热带农业科学院橡胶研究所,农业部热带作物栽培生理学重点开放实验室)，赵百锁(中国农业大学生物学院微生物与免疫学系,农业部农业微生物资源与应用重点实验室)，杨苏声(清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室)著《细菌钠离子输出系统的类型及其可能机制》。

在高盐条件下,绝大多数微生物通过拒盐策略适应其生存环境,其中,钠离子输出系统在维持细胞正常的盐浓度和pH稳态等生命活动过程中扮演十分重要的角色.细菌的钠离子输出系统包括初级钠泵和次级钠泵两种类型,前者所介导的钠离子输出与呼吸相偶联,后者又分为单亚基和多亚基两种类型。

该研究认为有关初级钠泵和次级钠泵转运钠离子的分子机制还停留在推测阶段。

2004年，徐瑞成、陈小义、呼文亮(中国人民武装警察部队医学院细胞生物学教研室)著《钠泵的信号转导作用》该研究发现钠泵作为P型ATPase超家族的成员之一,具有与其他一些重要蛋白质相互作用的结构基础。

实验研究也表明,钠泵作为受体,与其配体结合后,介导了细胞信号的传递,并对细胞增殖和死亡产生重要影响。

2000年，原卫清、王颢、吕卓人(西安交通大学第一医院心内科)著《正常SD大鼠组织钠泵α亚单位的基因表达》该试验系统研究了正常SD大鼠各组织内钠泵α亚单位三种异构体的分布情况。

采用分子生物学RT-PCR及免疫组织化学技术，检测正常大鼠多种组织内钠泵α1、α2及α3亚单位mRNA及蛋白水平的表达。

结果左室心肌主要表达α1与α2亚单位，α3亚单位表达较弱；肝脏中在mRNA水平α1亚单位表达较强，α2与α3亚单位较弱，而在蛋白水平三者表达均较弱；肾脏中主要表达α1亚单位，α2与α3亚单位较弱；肾上腺中α1亚单位的表达略高于α2与α3亚单位；动脉平滑肌中α2亚单位的表达略高于α1与α3亚单位；垂体中三种亚单位的表达均较强；下丘脑中α2与α3亚单位表达较强，α1亚单位表达较弱。

本研究系统揭示了正常大鼠多种组织内钠泵α亚单位三种异构体在mRNA及蛋白水平的表达情况，为钠泵生理及病理作用的进一步研究提供了理论及实验依据。

2000年，符云峰、李素琴、卢振敏、张北奇(河北省医学科学院实验医学研究所生化研究室)著《高钠盐摄入对钠泵抑制因子水平和钠-钾泵活性的影响》该研究探讨了长期摄入高钠盐饮食引发高血压的机理。

试验以普通饲料和1.5% NaCl溶液饲喂雄性大鼠6周,颈动脉插管直接测量血压,ELISA检测血浆中、肾上腺和下丘脑组织中哇巴因样物质(oubain-like compound, OLC)和前海葱苷原A样物质(proscillaridin-like compound, PLC)免疫反应性,在有和无哇巴因存在的条件下水解ATP测定Na+-K+-ATP酶活性。

结果表明高血压组动脉血压较对照组明显升高(P<0.001),体重、肾重、肾重/体重比率、血浆中及肾上腺和下丘脑组织中OLC和PLC水平分别明显高于对照组(P＜0.001),肾脏Na+-K+-ATP酶活性明显低于对照组(P＜0.001)即长期摄入高钠盐饮食可能通过体液容量扩张刺激肾上腺和下丘脑分泌OLC和PLC入血循环,抑制组织细胞特别是血管平滑肌细胞膜Na+-K+-ATP酶活性,引起细胞内Na+和游离Ca2+浓度升高而导致血压升高。

参考文献
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