紫杉醇半合成和产业化

1988 年 法国 Denis 等首次报道了以 10-去乙酰巴卡亭 III( 10-deacetylbaccatin III, 10-DAB) 图 5 为原料半合成紫杉醇 其后 美国 Holton 教授和法国的 Potier 教授等也以巴卡亭 III 为 原料半合成了紫杉醇 10-去乙酰巴卡亭 III 是从欧洲红豆杉 Taxus baccata 的枝叶中分离出来 的 其含量可达 0.1% 由于枝叶再生能力强 因此紫杉醇半合成可有较丰富的原料 1992 年在 NCI 主持召开的第二次红豆杉与紫杉醇研讨会上 Holton 等报道了紫杉醇的半合成路线 即利 用紫杉醇侧链 N-苯甲酰- 2R 3S -3-苯基异丝氨酸经酯化后与巴卡亭 III 相连接的方法 1994 年美国施贵宝公司(BMS)采用 Holton 教授半合成方法的专利生产半合成紫杉醇 1997 年 半合 成紫杉醇通过美国 FDA 批准上市 Holton 教授的半合成方法是弗罗里达州立大学科学家小组的 专利技术 目前被称为 FSU’s 紫杉醇半合成方法
用治疗卵巢癌病人比环磷酰胺+顺铂总有效率 79%~63%
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乳腺癌 紫杉醇单药治疗乳腺癌有效率可达 50%以上 与多柔比星联用治疗乳腺癌有 效率为 94% 紫杉醇与顺铂治疗的总有效率为 52%~92%
Kaposis 肉瘤 NCI 试验显示 135mg/m2 静注紫杉醇 持续 3 小时单药治疗爱滋病相关 的晚期 Kaposis 肉瘤 21 天为一疗程的有效率为 65% 包括部分应答 试验结果认为紫杉醇是 治疗 Kaposis 肉瘤的有效疗法
癌症是危及人类生命的第二大病种,仅次于心血管疾病,每年癌症的发病率是 700 万人 在我 国每 1 分钟就要死掉 4~5 个癌症病人 寻求紫杉醇新的药物来源是全世界科学家们孜孜以求的 目标 近 20 年来 相继有多学科多角度地探索性研究报道 其中有紫杉醇细胞培养 真菌发酵 全合成与半合成等等 其中 细胞培养生产紫杉醇不失为一种较理想的方法 但是其最高产率 仅为 22mg/L 细胞培养面临的主要难题有 1 紫杉醇低水平表达 2 由于植物细胞易于变 异 长时间培养后 紫杉醇含量降低 3 细胞对放大培养中的剪切耐受力低 4 产量不稳 定 只有这些问题解决之后 才能实现工业化生产 另一方面 细胞培养产出的细胞材料尚需 下游工艺分离纯化 其工艺过程与树皮枝叶提取紫杉醇方法完全相同 这样 两项成本的叠加
世界各国的红豆杉资源都很有限 据报道 美国有大约 100 万株红豆杉 太平洋红豆杉 而我国的红豆杉还不到 10 万株
紫杉醇的发现被认为是 人类迄今发现的最有效的抗癌药物 1992 年美国食品药品管理 局 FDA 批准紫杉醇上市和临床应用 作为广谱抗癌药物 紫杉醇对卵巢癌 乳腺癌 肺癌 食管癌 黑色素瘤 头颈部癌具有很好的疗效 紫杉醇现已在 60 多个国家获准临床应用
紫杉醇的化学合成可谓是 20 世纪最后 10 年中对有机合成的重大挑战 在迎接这场挑战中技术运用到有机合成中来 在生物-有机化学的融合 交叉 学科上做出了新的成就 紫杉醇化学合成的成功 无疑是手性合成化学领域的重大进展 是 20 世纪后期崛起的 手性药物 工程的很好例证
自美国施贵宝公司 BMS 于 1992 年上市紫杉醇后 此后 8 年内 BMS 都是紫杉醇专利 药持有者 但在 2000 年后 BMS 经过与 Ivax 公司一次旷日持久的斗争后失去了该药在美国的 专利保护 Ivax 公司的口服紫杉醇产品 Onxol 获准上市 使美国向非专利紫杉醇敞开了大门 至今已有多种非专利紫杉醇药物上市 紫杉醇的专利权和排它权 exclusivity 均于 1997 年 12 月 29 日到期 其中包含 NP 和 NCE 新药物和新化学实体 new dtug product, new chemical entity
图 ３ 微管聚合与解聚
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紫杉醇与微管蛋白的相互作用受 -微管蛋白的第 270 和 364 位氨基酸残基调节 结合位点 在 -微管蛋白 N 末端的 31 个氨基酸片段和 217~231 位的氨基酸片段 可体外诱导微管蛋白在 低温 不含 GTP 或 MAPs 条件下形成超稳定微管结构 对 Ca2+和低温的解聚作用有一定的抗性 紫杉醇有很强的抑制肿瘤细胞活性 IC50 值小于 10nmol/L 耐药细胞株系除外 紫杉醇实质上 是一种抗微管药物 为细胞有丝分裂抑制剂或纺锤体毒物 spindle poison 在有丝分裂期 纺 锤体需要作为细胞骨架的微管解聚才能形成 而染色体也只有在纺锤体和纺锤丝的牵引下向两 极移动才能完成有丝分裂 紫杉醇使微管不能解聚 不能形成纺锤体和纺锤丝 从而不能牵动 染色体向细胞两极移动 使细胞不能完成有丝分裂 导致微管成束而致使细胞凋亡于 G1-G0 期 另一环节 在 S-G2 期 微管发生中心 microtubules organizing center, MOTC 进行复制 即由 一个 MOTC 复制成两个 MOTC 此时在紫杉醇作用下 细胞微管形成无序排列的星状体 则 细胞在 G2-M 期死亡 图 4
图 ５ １０－去乙酰巴卡亭 ＩＩＩ 半合成紫杉醇是以 10-去乙酰巴卡亭 III 作为母核 首先用硅烷基团保护 7 位羟基 再乙酰 化 10 位羟基 在 DMAP 存在下与侧链前体缩合 然后水解除去 7 位保护和 2 上的乙氧基乙基 成为紫杉醇 图 6
图 ６ 紫杉醇半合成路线 半合成紫杉醇关键中间体 紫杉醇 C-13 侧链的手性合成和紫杉醇半合成两项技术已经获准 国家知识产权局的发明专利公开 该专利技术现已落户上海 2003 年下半年完成中试试验之后 开始大规模生产
据.悉 截止 2003 年末 美国 BMS 和 AVENTIS 等公司申报的有关紫杉醇半合成的专利有 21 项 归纳起来约有 89 条权利要求条款 构成保护知识产权的壁垒 我们研发的半合成紫杉醇 专利技术是在全面了解那 89 条权利保护的前提下 立足创新 独辟蹊径 绕过壁垒 无论是在 合成策略 合成路线和合成发方法上均有别于美国专利 不构成对其侵权 我们十分清楚 只 有如此 我们的半合成紫杉醇才有希望叩开 FDA 的大门 才有可能参与和施贵宝的竞争
非小细胞肺癌 紫杉醇单药治疗非小细胞肺癌有效率 18.5% 紫杉醇与 DDP 联合 39.4%有效 紫杉醇+卡铂 CBDCA 合用 有效率为 41.8%
胃癌 局部未切除或转移性胃癌患者给予紫杉醇 175mg/m2 和氟尿嘧啶 1.5mg/m2 治疗 共进行 7 个周期 4 个月后研究人员观察到有 65.5%的病人产生客观缓解 其中 24.1%的病人完 全缓解 41.4%的病人部分缓解 1.2 专利及行政保护
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将使终产品紫杉醇在价格上失去市场竞争能力 至于真菌发酵法目前也只有实验室意义 无报 道认为有实用价值 紫杉醇全合成无疑是天然产物有机合成史上的丰碑 但是因步骤冗长烦琐 产率过低 不可能实现工业化生产 比较之下 半合成紫杉醇则是最具商业应用价值的技术 阎家麒教授领导的紫杉醇课题组曾在我国最早报道了紫杉醇提取纯化 纯度测定以及新型控释 缓释制剂 紫杉醇隐形脂质体 紫杉醇微乳 等系列研究 1994 年至 1996 年 在参与我国红豆 杉资源考察的过程中 我国红豆杉资源的贫乏的现实促使他们改变了研究方向 提出 战胜癌 症不再以毁灭红豆杉为代价 的科研宗旨 临床需要的紫杉醇必须满足 又要从根本上有效地 保护红豆杉不被灭绝 那么 研究工作的重点必须由植物提取转移到化学合成方法上来 经过 3 年的精心探索 刻苦钻研 无数次地试验 紫杉醇半合成终于取得了成功 3. 紫杉醇半合成方法的创新
根据国家药品食品监督管理局发布的第 45 号药品行政保护公告 罗纳普郎克 乐安公司的 多烯紫杉醇及其注射液未获行政保护 因而在我国开发多烯紫杉醇及其注射液不受专利和行政 保护的限制 2. 紫杉醇的药源开发
红豆杉属植物中紫杉醇含量极低 约 0.009%左右 实际生产 1kg 紫杉醇 需要大约 20 吨 红豆杉树皮 即需毁掉 3000 多株百年以上的红豆杉 然而 依我国现存红豆杉的数量 用不了 5 年 红豆杉这个物种在我国就要彻底灭绝了 为了保护我国的红豆杉资源 2002 年我国最高 人民法院作出司法解释 凡采用红豆杉生产紫杉醇或经营其产品的企业或个人 均属非法生产 和非法经营并以相应罪名处罚 我国目前所有用我国红豆杉植物提取紫杉醇的生产厂家以及经 营企业全部被责令停产 关闭和依法查处 在中国 采用红豆杉提取紫杉醇的时代已告结束
紫杉醇半合成及其产业化
阎家麒 王九一 1 江苏佩沃特生物基因工程有限公司 常熟 215500 1 河南省分析测试中心 郑
州 450003
1963 年 美国科学家 Wall 和 Wani 从太平洋红豆杉 Taxus brevifolia 的树皮中得到一种 粗提物 发现对离体培养的肿瘤细胞 包括 L1210 和 P288 白血病 Walker256 肉瘤及 B16 黑 色素瘤细胞都具有很强的抑制作用 便开始从粗体物中分离抗癌活性成分 但由于该成分在树 皮中含量极低 加之分离困难 直到 1971 年才与 McPhail 一起通过 X 射线分析确定了该活性成 分的化学结构 并将其命名为紫杉醇 Taxol, paclitaxel 1. 红豆杉与紫杉醇
图 ４ 紫杉醇在细胞周期中的抗丝分裂期作用
结构与活性研究表明 C-13 侧链和 D 环的四元环对活性起关键作用 侧链被除去和 D 环 开环都没有活性 此外 2-位的 C6H5CO 被除去 其活性也大大降低 9-位羰基还原成羟基后活 性有所增强 １ ． １ ． ２ 紫杉醇适应症与疗效
紫杉醇是一种广谱抗癌药物 其适应症及疗效如下 卵巢癌 其他化疗失败的卵巢癌患者使用紫杉醇可达 30%的缓解率 紫杉醇与顺铂合
与 Holton 教授的 FSU’s 紫杉醇半合成方法不同 阎家麒教授的半合成方法虽然也采用 10去乙酰巴卡亭 III 为原料 但所采用的侧链并非是 N-苯甲酰- 2R 3S -3-苯基异丝氨酸 而是 C-13 侧链前体 该侧链前体在与 10-去乙酰巴卡亭 III 缩合时 氮杂环会同时打开成为侧链 而 且 在侧链前体的合成中 采用动物肝脏酯酶高对映选择性水解消旋体中的( 3S)-乙酰基 使得 的侧链前体为手性化合物 以最简捷的路线合成紫杉醇 从而提高了半合成紫杉醇的产率 而 FSU’s 紫杉醇半合成方法则是采用消旋体侧链 我们的紫杉醇半合成专利技术与美国的另一个不 同点是 C-13 侧链前体的手性合成 起始原料使用化工产品苯甲醛和化肥氨水 只需 5 步反应 高收率 高纯度 99.4% 地得到侧链前体 而 FSU’s 紫杉醇半合成方法是采用高价格 高纯度 的对甲氧基苯氨