分析化学 高效液相色谱法

第十八章 高效液相色谱

学习指导与基本要求：

高效液相色谱法又称为高压液相色谱法或高速液相色谱法。它是在经典液相柱色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检测器而发展起来的快速分离分析技术，具有分离效率高、检测限低、操作自动化和应用范围广的特点。

具体要求如下：掌握高效液相色谱法和气相色谱法区别和联系；

掌握高效液相色谱仪的组成，采用梯度洗脱的优点；

掌握高效液相色谱仪的检测器：紫外光度检测器、荧光检测器、示差折光检测器工作原理；

掌握影响色谱峰扩展的因素及分离条件选择；

掌握高效液相色谱固定相和流动相；

了解：高效液相色谱分离类型的选择；高效液相色谱在药物分析和临床检验中的应用。

概述

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。

经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9×107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、灵敏度高、操作自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。

为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：

一、HPLC与经典LC区别

HPLC与经典LC的主要区别在于固定相、输液设备和检测手段。

经典LC仅做为一种分离手段；其柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀；采用常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓），分析周期长，无法在线检测。

HPLC可用于分离和分析，其柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱），采用高压输送流动相，柱效高（H↓，n↑），分析时间大大缩短，可以在线检测。

二、HPLC与GC差别

HPLC和GC的共同点是兼具分离和分析功能，均可以在线检测，其主要差别为分析对象的差别和流动相的差别。

1．分析对象

GC的分析对象为能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，可检测的样品约占有机物的20%

HPLC的分析对象为溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，可检测的样品约占有机物的80%。

2．流动相差别

GC的流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。

HPLC的流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广，流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用，选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性。3．操作条件差别

GC的操作条件为加温、常压操作，而HPLC一般为室温、高压操作。

第一节高效液相色谱法的主要类型及其固定相和流动相

一、高效液相色谱法主要类型

近年来，高效液相色谱法发展迅猛，在经典液相色谱各类方法的基础上，又有许多方法不断涌现和完善。高效液相色谱法可通过固定相分类，也可通过分离机理分离，可分为以下几种：

以下将简单介绍几种液相色谱方法。

二、高效液相色谱的固定相

HPLC的固定相大致可以分为两类：液－固吸附色谱固定相和液—液分配色谱固定相，液－固吸附色谱固定相通常为吸附剂，液—液分配色谱固定相有两种，为涂渍和化学键合相。涂渍法的固定相由于固定相容易流失，已经很少使用，而化学键合相由于其稳定性，被广泛使用。

1、液—固色谱固定相

1.硅胶：无定形多孔硅胶、球形全多孔硅胶、堆积硅珠

2.氧化铝：分为球形(5～10μm)和无定形(5～10μm)两种

3.高分子微孔多球(有机胶)

4.其它：⑴分子筛；⑵聚酰胺等。

2、化学键合相

¾键合反应：目前使用的化学键合相主要为硅氧烷（Si-O-Si-C)型键合，以氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应制得。

键合相可分为四种键型：

（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相

将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。

（2）硅氮型（=Si-N=）键合相

如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。

（3）硅碳型（=Si-C=）键合相

将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。

（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相

将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。

化学键合相根据键合的基团的不同，分为以下三类：

1、非极性键合相：

C18柱(ODS)是最常用的非极性键合相。常用的还有C8柱、C1柱、苯基柱、芘基柱等。

2.弱极性键合相：

常见的有醚基键合相、二羟基键合相。

3、极性键合相：

强极性－氨基键合相(分析糖类)；中强极性－氰基键合相。

化学键合相一般用硅胶作载体，具有分配作用和一定的吸附作用。吸附作用的大小视覆盖度或含碳量而定。用化学反应方法将载体表面上残存的硅醇基除去，称为封尾，所形成的键合相称为封尾键合相，完全封尾的键合相无吸附作用，缺点是疏水强。

化学键合相有以下特点：

①、化学稳定性好，使用过程不易流失，柱寿命长；

②、均一性和重现性好

③、柱效高，分离选择性好；

④、适于作梯度洗脱。

⑤、载样量大；

在使用时，需要注意的事项：

①、在pH2~8的溶液不变质，过酸过碱，硅胶溶解；

②、不同厂家不同批次性质可能略有不同。

3、其他固定相

1、键合型离子交换剂

现常采用离子型键合相，多以BKG、YWG及YQG为载体，表面经化学反应键合上各种离子交换基团，如-SO3H , -CH2NH2 , -COOH , -CH2N(CH3)Cl等时，形成了所谓的离子性键合色谱。其分离原理与离子交换色谱一样，只是填料是一种新型的离子交换剂而已。

三、高效液相色谱的流动相

气相色谱法中，可供选择的载气只有3～4种，其性质相差也不大，因而是以改变柱温与选择固定相来改善分离效果；在液相色谱中，溶剂选择种类很多，且可组成多元溶剂及不同配比溶剂，余地很大。当固定相一定时，流动相的种类、配比直接影响分离效果（除SEC外）。1、液相色谱的流动相必须符合下列要求：

（1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。

（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。

（3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。

（4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光；若使用示差折光检测器（利用样品池和参比池之间折光率的差别来对组分进行检测，测得的折光率差值与