重组体克隆筛选和鉴定
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
重组体克隆筛选和鉴定
酶切前
酶切后
载体
重组体克隆筛选和鉴定
插入片断
Southern blot 筛选
结果
重组体克隆筛选和鉴定
（1）原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
重组体克隆筛选和鉴定
重组体克隆筛选和鉴定
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
重组体克隆筛选和鉴定
3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白
质粒蛋白A 外源蛋白B
重组体克隆筛选和鉴定
重组体克隆筛选和鉴定
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
重组体克隆筛选和鉴定
第二节外源基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
受体菌：his外源基因：his+
重组体克隆筛选和鉴定
pBR322
重组体克隆筛选和鉴定
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青 霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
重组体克隆筛选和鉴定
缺点：需要电镜！
重组体克隆筛选和鉴定
2. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
重组体克隆筛选和鉴定
第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
重组体克隆筛选和鉴定
二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载 体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
重组体克隆筛选和鉴定
A
B
A或B
重组体克隆筛选和鉴定
来自百度文库
重组体克隆筛选和鉴定
不同克隆的酶切结果
重组体克隆筛选和鉴定
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
重组体克隆筛选和鉴定
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
重组体克隆筛选和鉴定
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片 段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的半乳糖苷酶。
重组体克隆筛选和鉴定
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
重组体克隆筛选和鉴定
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
重组体克隆筛选和鉴定
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
重组体克隆筛选和鉴定
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
重组体克隆筛选和鉴定
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
重组体克隆筛选和鉴定
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
重组体克隆筛选和鉴定
2. 放射性抗体检测法过程
无环丝氨酸培养基
重组体克隆筛选和鉴定
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
重组体克隆筛选和鉴定
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
第六章重组体克隆筛选和鉴 定
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
重组体克隆筛选和鉴定
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
重组体克隆筛选和鉴定
酶切前
酶切后
载体
重组体克隆筛选和鉴定
插入片断
Southern blot 筛选
结果
重组体克隆筛选和鉴定
（1）原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
重组体克隆筛选和鉴定
重组体克隆筛选和鉴定
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
重组体克隆筛选和鉴定
3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白
质粒蛋白A 外源蛋白B
重组体克隆筛选和鉴定
重组体克隆筛选和鉴定
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
重组体克隆筛选和鉴定
第二节外源基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
受体菌：his外源基因：his+
重组体克隆筛选和鉴定
pBR322
重组体克隆筛选和鉴定
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青 霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
重组体克隆筛选和鉴定
缺点：需要电镜！
重组体克隆筛选和鉴定
2. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
重组体克隆筛选和鉴定
第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
重组体克隆筛选和鉴定
二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载 体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
重组体克隆筛选和鉴定
A
B
A或B
重组体克隆筛选和鉴定
来自百度文库
重组体克隆筛选和鉴定
不同克隆的酶切结果
重组体克隆筛选和鉴定
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
重组体克隆筛选和鉴定
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
重组体克隆筛选和鉴定
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片 段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的半乳糖苷酶。
重组体克隆筛选和鉴定
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
重组体克隆筛选和鉴定
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
重组体克隆筛选和鉴定
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
重组体克隆筛选和鉴定
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
重组体克隆筛选和鉴定
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
重组体克隆筛选和鉴定
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
重组体克隆筛选和鉴定
2. 放射性抗体检测法过程
无环丝氨酸培养基
重组体克隆筛选和鉴定
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
重组体克隆筛选和鉴定
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
第六章重组体克隆筛选和鉴 定
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
重组体克隆筛选和鉴定
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
重组体克隆筛选和鉴定