生物制药 第三章 基因工程制药 基因工程药物制造实例和质量控制
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µg)，任何药物性质或剂量上的偏差，都可能 贻误病情甚至造成严重危害。
• 基因工程药物需要在宿主细胞中表达的 外源基因，在转录或翻译、精制、工艺 放大过程中，都有可能发生变化，所以 从原料—制备过程—产品的每一步都必 须严格控制条件和鉴定质量，确保产品 符合质量标准、安全有效。
一、原材料的质量控制
1. hIFN-ɑ2b基因的获得 • 用于克隆的人ɑ2b干扰素基因是应用PCR方法
从带有人ɑ2b干扰素基因的染色体片段获得的： 模板DNA 4ng，引物为50pmol/L，各25µL 4×dNTP 4µL，TaqDNA聚合酶2.5µL， 10×PCR反应缓冲液10µL，补水使总反应体积 为100µL。反应条件：变性温度为94 ℃，退火温 度为50℃，链延伸温度为72 ℃ 。共30个循环。
第八节 基因工程药物制造实例
一、干扰素 二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 三、人白细胞介素-2 四、美洲商陆抗病毒蛋白
干扰素（interferon，IFN）是人体细胞 分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重 要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分 为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在 分为ɑ1b，ɑ2a ，ɑ2b等亚型，其区别表现在个 别氨基酸的差异上。
⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品应做干扰素效价测定、无
菌试验、热原质试验。
⒉ 成品检定
⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验 美洲商陆
第九节 基因工程药物的质量控制
• 基因工程药物与传统意义上的一般药品的生产不同， 首先它是利用活的细胞作为表达系统，所获蛋白质产 品往往相对分子质量较大，并具有复杂的结构；许多 基因工程药物还是参与人体一些生理功能精密调节所 必需的蛋白质，极微量就可产生显著效应(每剂量的用 量：白介素-12仅0.1 µg， ɑ干扰素也只有10~30
扩增杂交质粒
筛选抗青霉素但对氨苄
青霉素敏感细菌克隆
用杂交翻译法挑选
含干扰素cDNA克隆
将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌中进行高效表达
二、基因工程干扰素的制备
启开种子
制备种子液
发酵培养
粗提
精提
半成品制备
半成品检定
分装
冻干
成品检定
成品包装
制备基因工程干扰素ɑ的工艺流程图
三、人ɑ2b型干扰素(hIFN—ɑ2b)工
• (2)杂质 基因工程产物的杂质包括蛋白 质和非蛋白质两类。
• 通常需要检测的杂质及其检测方法见下 表。
基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法
3．生物活性测定 • 生物活性测定是保证基因工程药物产品
有效性的重要手段，往往需要进行动物体 内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。
4．稳定性检验 • 药品的稳定性是评价药品有效性和安全
程菌株的组建过程
• 应用PCR的方法，从人的染色体片段制备人 ɑ2b干扰素的cDNA，将其克隆到pRC23表达 载体上，构建成重组表达质粒pMZI2B，并转 化大肠杆菌DH5a，组建成工程菌株。由于 pMZI2B的ɑ2b基因5’端起始密码ATG上游编 制了一段SD顺序，与PL启动子上连接的SD顺 序组成双SD顺序，所以克隆基因的表达水平 有明显的提高。
二、培养过程的质量控制 • 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆
纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌 所含的质粒稳定，始终无突变；在重复 生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能 排除外源微生物污染。
三、纯化工艺过程的质量控制
• 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确
证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、 DNA与热原质都控制在规定限度以下。 • 在精制过程中避免宿主细胞蛋白质、核酸、糖 类、病毒、培养基成分等的污染，并用相应的 方法进行检测。
③应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检 定结果及其生物学特性等；
④需阐明载体引人宿主细胞的方法及载体在宿主 细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其 中的拷贝数、宿主细胞与载体结合后的遗传稳 定性；
⑤提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核 苷酸序列，在生产过程中，启动与控制克隆基 因在宿主细胞中表达的方法及水平等。
• 原材料的质量控制是要确保编码药品 的DNA序列的正确性，重组微生物来自 单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证 产品质量的安全性和一致性。
• 应该了解：
①需要明确目的基因的来源、克隆经过、限制性 内切酶酶切图谱、核苷酸序列；
②应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其 各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能， 构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志 物；
五、产品的保存
1、液态保存 （1）、低温保存 （2）、稳定pH条件下保存 （3）、高浓度保存 （4）、加保护剂保存
• 蛋白质的稳定剂有糖类、脂肪类、蛋白质类、 多元醇、有机溶剂等；有些蛋白质在高离子强 度的极性环境下才能保持其活性，加入中性盐 可稳定这些蛋白质；某些蛋白质表面或内部含 有半胱氨酸巯基，容易被空气中的氧缓慢氧化 为次磺酸或二硫化物，使蛋白质的电荷或构象 发生改变而失活，可加入β-巯基乙醇、二硫 苏糖醇等，在真空或惰性气体中密闭保存。
2．纯度分析 纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，
它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两 个方面的内容。
(1)目的蛋白质含量测定 测定蛋白质含量的方法 可根据目的蛋白质的理化性质和生物学特性来 设计。通常采用的方法有还原性及非还原性 SDS-PAGE、等电点聚焦、各种HPLC、毛细 管电泳(CE)等。
2、固态保存 • 固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量
降到5％时，在室温或冰箱中保存均比较稳定， 但在37℃保存时活性则明显下降。
• 长期保存蛋白质的最好方法是把它们制成干粉 或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定 性，在干燥器中，4℃以下可保存相当长的时 间。
第三章 基因工程制药思考题（4）
2．重组表达质粒pMZI2B的构建 • pGEM-3／ɑ2bB质粒经EcoR I和
BamH I双酶解，切下ɑ2b-B片段，纯化 后克隆到质粒pRC23的EcoR I和BamH I 位点上，构建成重组表达质粒 pMZI2B(见图)。
3．人ɑ2b型干扰素工程菌株的形成与基 因的表达
• 将重组表达质粒pMZI2B转化大肠杆 菌DH5a形成工程菌。经37 ℃摇床培养 后进行抗病毒活性检测。
• 采用PCR技术扩增的人ɑ2b干扰素基因 片段，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，其片 段大小约相当于0.55kb。将该片段插入 质粒pGEM-3的EcoR I和BamH I的位点 上，转化大肠杆菌DH5a，培养后提取质 粒DNA，用引物SP6和T7从两端测定 DNA顺序。结果证明其顺序与文献报道 的基因顺序是一致的。
1、设计一个实验方案用基因工程的方法 生产人干扰素α2b。
2、常用的基因工程药品的保存方法有哪 些？
Have a rest !
性的重要指标之一，也是确定药品贮藏 条件和使用期限的主要依据。
• 采用恰当的物理化学、生物化学和免疫 化学技术对其活性成分的性质进行全面 鉴定，要准确检测在贮藏过程中由于脱 氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成 的分子变化。
5．产品一致性的保证 • 以重组DNA技术为主的生物制药是一
个十分复杂的过程，生产周期可达一个 月甚至更长，影响因素较多。需要对原 料—生产—产品的每一环节都进行严格 的控制和质量检定，才能确保各批最终 产品都是安全有效、含量和杂质限度一 致并符合标准。
• 结果表明，具有双SD序列的pMZI2B的 抗病毒活性(1.69x104IU／mL)，与仅具 有单SD序列的pMZI2A(其组建过程同上) 的抗病毒活性(3.46xl03IU／mL)相比， 有显著的提高。这是因为基因的表达水
平与转录和翻译两个主要环节密切相关，
而SD序列在蛋白质翻译中是核糖体的识 别和结合部位，因此，增加SD序列，即 增加了蛋白质翻译时核糖体的识别和结
一、基因工程菌的组建
构建干扰素工程菌流程图
一、干扰素基因工程菌的组建流程
诱生的白细胞
提取全RNA
通过寡dT-纤维素柱 获得寡A的mRNA
逆转录成cDNA
双链cDNA接上dT或dG尾
pBR322质粒
pBR322质粒加上dA或dC
蔗糖密度梯度 离心提取12s 的 产品的质量控制
• 需要综合利用生物化学、免疫学、微 生物学、细胞生物学和分子生物学等 多门学科的理论与技术所建立起来的 鉴定方法，以保证基因工程药品安全 有效。
1、产品的鉴定 ①肽图分析 ②氨基酸成分分析 ③部分氨基酸序列分析 ④重组蛋白质的浓度和相对分子质量测定 ⑤蛋白质二硫键分析
重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法
4.产品的提取与纯化
4,000r/min离心30分钟，去上清，得湿菌泥。
湿菌超声破碎，离心，取沉淀部分，溶液处理， 离心取上清液，上清超滤浓缩， Sephadex G50 分离。 经SDS-PAGE检查。 再经DE-52柱纯化人干扰素ɑ2b。
质量控制标准和要求
⒈ 半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定 ⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清IgG含量测定
合机率。
α2b干扰素的生产
4.发酵
工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用 PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1% 蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。摇床培 养30℃，10h，培养发酵罐种子。15L发酵罐培养， 30℃ ，8h。然后42℃ ，2-3h即可完成发酵。每 隔2h取样测OD或离心去上清称量菌体湿重。
• 基因工程药物需要在宿主细胞中表达的 外源基因，在转录或翻译、精制、工艺 放大过程中，都有可能发生变化，所以 从原料—制备过程—产品的每一步都必 须严格控制条件和鉴定质量，确保产品 符合质量标准、安全有效。
一、原材料的质量控制
1. hIFN-ɑ2b基因的获得 • 用于克隆的人ɑ2b干扰素基因是应用PCR方法
从带有人ɑ2b干扰素基因的染色体片段获得的： 模板DNA 4ng，引物为50pmol/L，各25µL 4×dNTP 4µL，TaqDNA聚合酶2.5µL， 10×PCR反应缓冲液10µL，补水使总反应体积 为100µL。反应条件：变性温度为94 ℃，退火温 度为50℃，链延伸温度为72 ℃ 。共30个循环。
第八节 基因工程药物制造实例
一、干扰素 二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 三、人白细胞介素-2 四、美洲商陆抗病毒蛋白
干扰素（interferon，IFN）是人体细胞 分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重 要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分 为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在 分为ɑ1b，ɑ2a ，ɑ2b等亚型，其区别表现在个 别氨基酸的差异上。
⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品应做干扰素效价测定、无
菌试验、热原质试验。
⒉ 成品检定
⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验 美洲商陆
第九节 基因工程药物的质量控制
• 基因工程药物与传统意义上的一般药品的生产不同， 首先它是利用活的细胞作为表达系统，所获蛋白质产 品往往相对分子质量较大，并具有复杂的结构；许多 基因工程药物还是参与人体一些生理功能精密调节所 必需的蛋白质，极微量就可产生显著效应(每剂量的用 量：白介素-12仅0.1 µg， ɑ干扰素也只有10~30
扩增杂交质粒
筛选抗青霉素但对氨苄
青霉素敏感细菌克隆
用杂交翻译法挑选
含干扰素cDNA克隆
将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌中进行高效表达
二、基因工程干扰素的制备
启开种子
制备种子液
发酵培养
粗提
精提
半成品制备
半成品检定
分装
冻干
成品检定
成品包装
制备基因工程干扰素ɑ的工艺流程图
三、人ɑ2b型干扰素(hIFN—ɑ2b)工
• (2)杂质 基因工程产物的杂质包括蛋白 质和非蛋白质两类。
• 通常需要检测的杂质及其检测方法见下 表。
基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法
3．生物活性测定 • 生物活性测定是保证基因工程药物产品
有效性的重要手段，往往需要进行动物体 内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。
4．稳定性检验 • 药品的稳定性是评价药品有效性和安全
程菌株的组建过程
• 应用PCR的方法，从人的染色体片段制备人 ɑ2b干扰素的cDNA，将其克隆到pRC23表达 载体上，构建成重组表达质粒pMZI2B，并转 化大肠杆菌DH5a，组建成工程菌株。由于 pMZI2B的ɑ2b基因5’端起始密码ATG上游编 制了一段SD顺序，与PL启动子上连接的SD顺 序组成双SD顺序，所以克隆基因的表达水平 有明显的提高。
二、培养过程的质量控制 • 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆
纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌 所含的质粒稳定，始终无突变；在重复 生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能 排除外源微生物污染。
三、纯化工艺过程的质量控制
• 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确
证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、 DNA与热原质都控制在规定限度以下。 • 在精制过程中避免宿主细胞蛋白质、核酸、糖 类、病毒、培养基成分等的污染，并用相应的 方法进行检测。
③应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检 定结果及其生物学特性等；
④需阐明载体引人宿主细胞的方法及载体在宿主 细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其 中的拷贝数、宿主细胞与载体结合后的遗传稳 定性；
⑤提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核 苷酸序列，在生产过程中，启动与控制克隆基 因在宿主细胞中表达的方法及水平等。
• 原材料的质量控制是要确保编码药品 的DNA序列的正确性，重组微生物来自 单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证 产品质量的安全性和一致性。
• 应该了解：
①需要明确目的基因的来源、克隆经过、限制性 内切酶酶切图谱、核苷酸序列；
②应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其 各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能， 构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志 物；
五、产品的保存
1、液态保存 （1）、低温保存 （2）、稳定pH条件下保存 （3）、高浓度保存 （4）、加保护剂保存
• 蛋白质的稳定剂有糖类、脂肪类、蛋白质类、 多元醇、有机溶剂等；有些蛋白质在高离子强 度的极性环境下才能保持其活性，加入中性盐 可稳定这些蛋白质；某些蛋白质表面或内部含 有半胱氨酸巯基，容易被空气中的氧缓慢氧化 为次磺酸或二硫化物，使蛋白质的电荷或构象 发生改变而失活，可加入β-巯基乙醇、二硫 苏糖醇等，在真空或惰性气体中密闭保存。
2．纯度分析 纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，
它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两 个方面的内容。
(1)目的蛋白质含量测定 测定蛋白质含量的方法 可根据目的蛋白质的理化性质和生物学特性来 设计。通常采用的方法有还原性及非还原性 SDS-PAGE、等电点聚焦、各种HPLC、毛细 管电泳(CE)等。
2、固态保存 • 固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量
降到5％时，在室温或冰箱中保存均比较稳定， 但在37℃保存时活性则明显下降。
• 长期保存蛋白质的最好方法是把它们制成干粉 或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定 性，在干燥器中，4℃以下可保存相当长的时 间。
第三章 基因工程制药思考题（4）
2．重组表达质粒pMZI2B的构建 • pGEM-3／ɑ2bB质粒经EcoR I和
BamH I双酶解，切下ɑ2b-B片段，纯化 后克隆到质粒pRC23的EcoR I和BamH I 位点上，构建成重组表达质粒 pMZI2B(见图)。
3．人ɑ2b型干扰素工程菌株的形成与基 因的表达
• 将重组表达质粒pMZI2B转化大肠杆 菌DH5a形成工程菌。经37 ℃摇床培养 后进行抗病毒活性检测。
• 采用PCR技术扩增的人ɑ2b干扰素基因 片段，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，其片 段大小约相当于0.55kb。将该片段插入 质粒pGEM-3的EcoR I和BamH I的位点 上，转化大肠杆菌DH5a，培养后提取质 粒DNA，用引物SP6和T7从两端测定 DNA顺序。结果证明其顺序与文献报道 的基因顺序是一致的。
1、设计一个实验方案用基因工程的方法 生产人干扰素α2b。
2、常用的基因工程药品的保存方法有哪 些？
Have a rest !
性的重要指标之一，也是确定药品贮藏 条件和使用期限的主要依据。
• 采用恰当的物理化学、生物化学和免疫 化学技术对其活性成分的性质进行全面 鉴定，要准确检测在贮藏过程中由于脱 氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成 的分子变化。
5．产品一致性的保证 • 以重组DNA技术为主的生物制药是一
个十分复杂的过程，生产周期可达一个 月甚至更长，影响因素较多。需要对原 料—生产—产品的每一环节都进行严格 的控制和质量检定，才能确保各批最终 产品都是安全有效、含量和杂质限度一 致并符合标准。
• 结果表明，具有双SD序列的pMZI2B的 抗病毒活性(1.69x104IU／mL)，与仅具 有单SD序列的pMZI2A(其组建过程同上) 的抗病毒活性(3.46xl03IU／mL)相比， 有显著的提高。这是因为基因的表达水
平与转录和翻译两个主要环节密切相关，
而SD序列在蛋白质翻译中是核糖体的识 别和结合部位，因此，增加SD序列，即 增加了蛋白质翻译时核糖体的识别和结
一、基因工程菌的组建
构建干扰素工程菌流程图
一、干扰素基因工程菌的组建流程
诱生的白细胞
提取全RNA
通过寡dT-纤维素柱 获得寡A的mRNA
逆转录成cDNA
双链cDNA接上dT或dG尾
pBR322质粒
pBR322质粒加上dA或dC
蔗糖密度梯度 离心提取12s 的 产品的质量控制
• 需要综合利用生物化学、免疫学、微 生物学、细胞生物学和分子生物学等 多门学科的理论与技术所建立起来的 鉴定方法，以保证基因工程药品安全 有效。
1、产品的鉴定 ①肽图分析 ②氨基酸成分分析 ③部分氨基酸序列分析 ④重组蛋白质的浓度和相对分子质量测定 ⑤蛋白质二硫键分析
重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法
4.产品的提取与纯化
4,000r/min离心30分钟，去上清，得湿菌泥。
湿菌超声破碎，离心，取沉淀部分，溶液处理， 离心取上清液，上清超滤浓缩， Sephadex G50 分离。 经SDS-PAGE检查。 再经DE-52柱纯化人干扰素ɑ2b。
质量控制标准和要求
⒈ 半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定 ⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清IgG含量测定
合机率。
α2b干扰素的生产
4.发酵
工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用 PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1% 蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。摇床培 养30℃，10h，培养发酵罐种子。15L发酵罐培养， 30℃ ，8h。然后42℃ ，2-3h即可完成发酵。每 隔2h取样测OD或离心去上清称量菌体湿重。