透明质酸的提取工艺研究3稿

透明质酸的提取工艺研究

摘要：论述了透明质酸的结构和理化性质，各种提取方法以及各方面的应用和发展前景。

关键词：生化药物，透明质酸 (HA),提取工艺

生物技术是21世纪技术的核心，它是利用生物体或其组织部分发展产品的技术体系，利用生物技术研究和开发的。生物技术药物与生化药物没有严格的界限，可以利用现代生化技术生产，还可以用化学方法合成或修饰，这些药物均具有疗效高、安全性强、生产污染小、原料取自天然、可生物利用等优点。在人类面临健康资源、环境、人口危机的今日，更显出其独有的魅力，在制药业已异军突起，而且生物技术制药市场方兴未艾。透明质酸是一种性能优良的生化物质，应用极其广泛，它的应用开发和生产是目前生化药界比较热门的课题。

引言

透明质酸（Hyaluronicacid简称HA）又名玻尿酸，是一种酸性粘多糖类高分子化合物，基本结构由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。分子式：（C14H20NNaO11）n，其结构式如下如所示：

与其它粘多糖不同，它不含硫。广泛存在于人和动物的结缔组织、眼球玻璃体、细胞间质、关节滑膜液、脐带、角膜、鸡冠、鸡胚及细菌壁中。由于其具有特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域得到了广泛的应用。它的透明质分子能携带500倍以上的水分，为目前所公认的最佳保湿成分，目前广泛的应用在保养品和化妆品中。

1 结构及理化性质

HA高聚物的结构单元由一分子D-一葡萄糖醛酸与一分子N-乙酸氨基葡萄糖以β-1，3糖苷键连接而成，此单元的N-乙酸胺基葡萄糖又以β-1，4 糖苷键与另一单元的D- 葡萄糖醛酸相连分子量通常为数十万。HA 具有以下理化特征：1）无定形物质；2）水溶液带负电；3）分子链间成紊乱的网状结构；4）水溶液有较好的粘弹性和渗透压；5）分子存在大量的羟基

2透明质酸的提取方法、

ＨＡ的生产工艺主要分为两大类：以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。本工艺中，组织提取法选取鸡冠为原料；细菌发酵法选取牛鼻粘膜，其含有能产生HA的链球菌。

2.1以鸡冠为原料的工艺流程

鸡冠（丙酮、脱水）→脱水鸡冠（蒸馏水）→滤液NaCl（氯仿提取）→水相（乙醇、沉淀）→透明质酸（脱水：干燥）→粗品（0.1mol/LＮaCl溶液）→溶解液（稀HCl，ＰＨ４·５、氯仿）→水相（NaOH pH7.7链酶蛋白酶）→酶解液（氯仿）→水相（氯化十六烷吡啶）→沉淀（CaCl离心）→上清液（95%乙醇：沉淀）→沉淀（脱水）→HA产品。

2.2发酵法生产

微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA 为主要成分的荚膜来生产HA。与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受动物原料限制、发酵液HA以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。

2.2.1实验材料：牛鼻黏膜140 份。

培养基。目前所用培养基氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。其中酵母浸膏最常用。在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸, 可以提高HA 的产率。碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物, 最常用的是葡萄糖。其他还有磷酸盐、硫酸盐、钾、钠、钙、镁等无机盐。此外, 为了获得高分子量的HA, 培养基中不能含有促使HA 降解的金属离子, 如铁离子、铜离子; 也不能加入自由基清除剂, 以防止HA 降解。

主要有以下几种: ①斜面培养基。牛脑沁液800 mL ,牛心沁液200 mL ,牛肉膏的质量分数为0. 3 % ,蛋白胨为1 % ,NaCl 为

0. 5 % ,琼脂为1. 8 % ,灭菌前p H = 7.0 ,121 ℃灭菌20 min 。②血琼脂平板培养基。葡萄糖的质量分数为2 %,蛋白胨为

1 %,牛肉膏为1 % ,MgSO4 •7H2O 为0. 1 % , KH

2 PO4 为0. 2 % ,琼脂为1. 6 %,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min. ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。③摇瓶培养基。葡萄糖的质量分数为4 % ,蛋白胨为1 % ,牛肉膏为

1 %,MgSO4 •7H2O 为0. 1 % , KH

2 PO4为0. 2 % ,灭菌前p H = 7. 0 ,121 ℃灭菌20 min ,冷却至50 ℃以下,无菌条件下加入体积分数为10 %的小牛血清。

2.2.2试验方法

菌种分离筛选操作方法

(1) 初筛。将牛鼻黏膜用0. 1 %蛋白胨溶液稀释成不同梯度涂于血琼脂平板,在37 ℃下培养24 h 。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态,用接种针挑起看其黏度、荚膜染色和革兰氏染色并镜检。

(2) 复筛。在发酵摇瓶中接入初筛疑似菌株,每株3 瓶,在200 r/ min , 37 ℃下培养24 h 。用红外吸收光谱对经复筛发酵液提纯得到的多糖精品作定性分析。

(3) 红外吸收光谱法。取HA 2 mg , KBr 压片,用IR2400 红外分光光度计在4000 ～ 500cm- 1 范围内扫描。

2. 2.3 诱变方法

人们研究发现，链球菌属和多种细菌都有荚膜，这种荚膜的主要成分是HA，同时，在这些细菌中也含有透明质酸酶，它使HA降解，所以，发酵法生产HA的基础是找到高产HA，又不产生透明质酸酶的菌种。

(1) 制备菌液。菌液经3500 r/ min 离心10min 后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤2 次,重新悬浮于5 mL 生理盐水中,摇匀后倒入盛有45 mL 灭菌生理盐水并带玻璃珠的100 mL 锥形瓶中,振荡10 min , 调整细胞浓度至108 / mL 。在进行诱变处理菌体时,用0. 1mol/ L 、p H = 6. 0 的磷酸盐缓冲液代替生理盐水,其他与供紫外线诱变处理菌体的菌液制备相同。

(2) 紫外线诱变处理。紫外灯的功率为15W ,照射距离为30 cm。将3 mL 菌液和磁力搅拌棒放入直径为9 cm 的无菌培养皿中,搅拌照射时间为2 min 。

(3) N TG 诱变处理。称取1 mg N TG 倒入无菌离心管中,加入0. 1 mol/ L 、p H = 6. 0 的磷酸缓冲液1 mL ,暗处振荡溶解。取

4 mL 菌液加入上述离心管中,充分摇匀,立即置于37 ℃水浴振荡处理30 min (N TG 处理终浓度为100 g/mL) 后,离心收集菌体,将含N TG 的上清液倒入浓NaO H 溶液弃去,用无菌水洗涤菌体3 次,用大量稀释法终止N TG 的诱变,最后向离心管中加

5 mL 无菌生理盐水。