7.植物组织的脱毒培养(植物组织培养)

第七章植物组织的脱毒培养

一、植物病毒的危害

病毒:一类结构简单生物，由核酸和蛋白质分子组成。病毒结构简单，没有完整的酶系统来独立地进行物质代谢和能量代谢，只能依靠寄主生物的酶系统实现生理代谢过程，因此，具有寄生性。

病毒侵入寄主后，在寄主细胞中进行自我复制而迅速增殖，并扩展到植物全株发病。

病毒病不同于真菌和细菌病害，不能用杀菌剂和抗菌素进行防治，与细胞共生，一旦染病，只能采用拨除病株的措施。

病毒危害：1）导致植物产量和品质的大幅度降低。2）通过无性繁殖或者种子传给下一代。

通过植物组织培养方法，可脱除植物病毒，恢复种性，使品种复壮，提高产量品质。

二、植物组织中病毒的分布

病毒在植物组织中分布不均匀：在顶端分生组织中含毒少，在老组织中病毒增加。（茎尖培养脱毒的理论依据）

植物茎尖分生组织无病毒原理（原因）：

(1) 能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA 合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。

(2) 传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在茎尖分生组织中，维管组织还不健全或不存在，从而抑制了病毒向分生组织的传导。

(3) 激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。

(4) 酶缺乏：1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。

(5)抑制因子：1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子，如“酶钝化系统” 。

三、脱除植物病毒的方法

(一)茎尖培养脱毒

1、根据培养目的和取材大小可将茎尖培养分为:

1）普通茎尖（Shoot tip）培养

较大茎尖（几毫米至几十毫米的茎尖）培养技术。技术简单，操作方便，茎尖易成活，成苗所需时间短，能加速繁殖速度。

2）茎尖分生组织( apical meristem )培养

仅限于幼龄叶原基顶端圆锥区，其直径和长度大约100～250μm，即小于0.3mm的茎尖为茎尖分生组织。

2、在茎尖培养中影响脱毒的因素

1）培养基：

营养成分：MS培养基，K+ NH4+含量

生长调节剂：少量的生长素（NAA,IAA)、细胞分裂素（6-BA）、GA3

2）外植体的大小：决定存活率的大小

三个因素：根除病毒、可以发育为完整植株的能力、带有叶原基。

3）培养条件：光照4000lx（照光比暗培养效果好，但对于易褐化的材料需一段暗培养）

温度：25±2℃（低温会使茎尖休眠，不利于萌发）。

4）外植体的生理状态：

顶芽茎尖比腋芽茎尖效果好；生长期的材料比休眠期好。

（二）热处理脱毒

热处理与茎尖培养结合，即可取较大的茎尖培养，大大提高茎尖成活率和增殖率，又达到消除病毒的目的。

1、方法：

热水:休眠芽（50 ℃热水浸渍数分钟～数小时）

热气:活跃的茎尖。温度35-50℃，处理时间长度各异。（处理时间长短可根据病毒浓度、寄主蛋白含量、温度高低来确定）

长时间高温处理不能提高脱毒效率，反而降低茎尖再生能力，可以采用逐渐升温、变温处理。

2、热处理脱毒的原理：

热处理法是利用病毒和寄主植物对高温的耐热性的差异。

⑴某些病毒受热后不稳定，高温使这些病毒失去活性，可以部分地或完全地被钝化。

⑵病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制。热处理钝化病毒的活性后，病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。

⑶高温下，一方面不能生成或生成病毒很少，另一方面对病毒的破坏作用加重，病毒颗粒生成和破坏的平衡程度受到

破坏，使感染植株的病毒含量不断降低，经过一段时间，病毒自行消失而达到脱毒的目的。

（三）愈伤组织脱毒

研究表明，在愈伤组织培养过程中，随着愈伤组织的迅速增生，病毒感染的程度会明显降低。

经过多次继代培养，新产生的愈伤组织的分散程度增加，染病的几率会越来越小，从愈伤组织诱导生产的试管苗，就会得到脱毒的再生植株。

原因：①细胞的增殖速度快于病毒复制的速度；②细胞产生变异，获得对病毒感染的抗性，最终表现出脱毒现象。

（四）微体嫁接脱毒

微体嫁接法：将茎尖（<0.2mm）作为接穗嫁接到实生苗砧木上，一起在培养基上培养的方法。

适用茎尖难以生根形成植株的一些木本植物。此方法消除病毒的几率和获得无病毒苗的可能性大，在柑橘和苹果上获得成功。利用这个方法，柑橘类嫁接成活率为30%～50%，移栽成活率约95%，嫁接两年后即可结实。

（五）珠心胚培养脱毒

珠心组织与维管束没有联系，故可以培养珠心组织得到无病毒植株。

（六）化学疗法：

在培养基中加入一定浓度的2-硫脲嘧啶，可消除烟草组织中的PVY病毒。病毒抑制剂：2，4-D、碱性孔雀绿等。

四、无病毒植株的鉴定

1 直接测定法：形态、症状

2 指示植物法

指示植物：接种后某种病毒能迅速表现典型或特有症状的植物。

如：千日红、苋色藜、灰藜等植物。病毒可以在指示寄主植物上产生典型或特异的病毒病症状，利用这一原理，将待测植物的汁液接种到寄主植物上，根据侵染与否以及侵染程度来确定脱毒效果。

例如：PVX感染千日红植物后，表现红色环状斑纹。SwPLV感染苋色藜后出现枯斑。

3 抗血清鉴定法

植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是较好的抗原

给动物注射病毒后，动物在外来抗原刺激下产生的免疫球蛋白，叫做抗体，存在于血清中。含抗体的血清为抗血清。抗血清的制备：纯化的病毒注射到实验动物中，一段时间后采集血清。

血清鉴定方法的原理：主要根据抗体和抗原的特异沉淀反应。

具体方法有：试管沉淀、琼脂双扩散法、免疫扩散、ELISA等。

酶联免疫吸附反应鉴定法（ELISA）：ELISA是采用酶标记的抗体来指示抗原抗体结合的微量测定法。

①将抗体固定在支持物上；②加入被检测的植物提取液；③然后加酶（某种过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体；

④最后加入该种酶反应底物。

4、电子显微检测法

采用透射电镜的方法，可直接检测出有无病毒的存在，可得知病毒的大小、形状、结构，并能观察到病毒在器官和细胞内的分布情况。

电子显微镜分辨能达到0.5μm，可显示细胞与组织中病毒的精确定位和各种形态变化。

5、核酸分析法：

通过核酸杂交或PCR法检测目标病毒的核酸序列。

五、无病毒植株的快繁与保存

培养快繁：得到脱毒无性系，即可继代繁殖。或低温保存。

无毒种苗繁殖

为了生产需要，获得无毒种苗应在大田进行扩繁。因为脱毒苗并不具备额外抗病能力，即在大田生长中有可能重新感病。

无虫网室扩繁种苗（马铃薯）。

选择隔离区，无病原地带。

脱毒种苗的繁殖

脱毒苗→原原种→原种（一级、二级）→种苗（种薯）（一级、二级）

防虫网室良好隔离条件

温室