猪流行性腹泻新型疫苗的研究进展

养猪SWINE PRODUCTION

2015第4期

猪流行性腹泻新型疫苗的研究进展

程杰1，栾慧1，吴家强2，彭军1

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271000；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南250100）中图分类号：S859.79+7文献标志码：A文章编号：1002-1957(2015)04-0097-05

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性接触性肠道传染病。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属。病毒粒子呈多形性，倾向圆形，直径约95~190nm，外有囊膜（Envelope）。本病毒人工培养很难成功。进行交叉中和试验、猪体交互保护试验、ELISA（酶联免疫吸附试验）等，都证明本病毒与猪传染性胃肠炎病毒没有共同的抗原性。病毒对外界环境和消毒药抵抗力不强，对乙醚、氯仿等敏感，一般消毒剂都可将其杀死。猪流行性腹泻仅发生于猪，各品种、年龄、性别的猪都同样易感，以寒冷的12月、1月和2月发生最多，于4~6d内可以传遍整个猪场。哺乳仔猪受害最为严重，表现为呕吐水泻不停，1周龄内的新生仔猪发生腹泻后3~4d，呈现严重脱水而死亡，死亡率平均为50%，有时可达100%。病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝。生长肥育猪表现为4~6d的水泻，死亡率为1%~3%，大多较快康复，但生长发育受到一定影响。母猪仅见精神不好、厌食和数日的拉稀后康复，常见腹痛状表现。病变主要出现在小肠，病猪小肠内充满黄色液体，肠绒毛萎缩，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿。腹泻开始时，排黄色黏稠粪便，以后变成水样并含有黄白色凝乳块，肠道黏膜分泌型IgA抗体（SIgA）能抵御入侵的病原体。根据临床症状、流行情况和病理变化，一般可以做出初步诊断。

猪流行性腹泻疫苗是将病原微生物猪流行性腹泻病毒及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。

传统疫苗主要包括减毒活疫苗和灭活疫苗，新型疫苗包括转基因植物疫苗、乳酸杆菌疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、多价联合疫苗等。

与多数病毒病一样，对PED的治疗以接种疫苗预防为主。兽用疫苗主要经历了灭活疫苗、弱毒疫苗以及基因工程苗3个阶段，现在灭活疫苗和弱毒疫苗在市场上应用较广，而且其对PED的针对性比较高。但随着科学技术的不断进步，基因工程苗会成为研究的主要方向。其中，核酸疫苗相比传统疫苗有许多优势，被誉为“第三次疫苗革命”。

鉴于接种疫苗对PED治疗的针对性及有效性，在生产实践中，为降低猪流行性腹泻对猪场造成的损害，猪病研究人员近年来潜心研制了高效、持久的PED相关疫苗，旨在为猪场提供一个安全、保障的环境。

1PED灭活疫苗

该病灭活疫苗的优点是安全性好，缺点是需多次注射。有时由于毒株毒性的丧失，免疫原性也随之消失。灭活苗大多需要佐剂才能增强免疫效果。

1.1PED组织灭活苗

1993年王明等[1]通过接种仔猪PEDV，当仔猪有典型的发病症状后，剖杀、采集其小肠组织及内容物并灭活，经后海穴注射接种的方法，成功制备了组织灭活苗，从而结束了PED无疫苗的历史。该疫苗对仔猪的主动保护率为85%，被动保护率为97.06%，免疫期可长达6个月。组织灭活苗目前被广泛应用，但同时组织灭活苗存在着制备繁琐、生产成本高、疫苗质量难以控制的缺点。

1.2PED细胞灭活苗

1994年，马思奇等[2]研究员通过向培养液中加入适量胰酶的培养方法，将PEDV CV777适应Vero 细胞，以28代毒制备灭活苗，主动保护率与被动保护率均达到了85%。制备细胞灭活苗的方法比较方便，被广泛应用。这是现在预防和控制PEDV的有效方法。

灭活疫苗具有安全、稳定的优点，而且母源抗体对免疫效果的影响比较小，免疫妊娠母猪后，产生的

收稿日期：2015-06-23

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划课题（2015BAD12B03）

作者简介：程杰（1994-），女，山东安丘人，主要从事猪病检测方法研究.E-mail:1536933557@

通讯作者：彭军，山东诸城人，副教授，博士，主要从事猪病病毒学与免疫防控研究.E-mail:jpeng@ 97

DOI:10.13257/ki.21-1104/s.2015.04.031

母源抗体对仔猪有一定的保护性。但是，灭活疫苗需要大剂量接种，经后海穴注射接种产生完全免疫力需要2周时间，不能起到紧急预防接种的作用，也不能有效降低疫苗的费用。灭活疫苗只能通过注射免疫，不能引起局部免疫，仔猪无法获得SIgA，保护效果不佳。

2PED弱毒苗

由于灭活苗存在一定的缺点，不能有效控制PED，促进了研究人员对弱毒疫苗的研究与制备。目前，研制成功的弱毒疫苗主要有：我国的CV777株、日本的P-5V株和韩国的KPED-9株、DR13株。

国内佟有恩等[3]研究员经过各项试验结果表明：PEDV CV777株弱毒株符合制备弱毒疫苗对毒株的要求。国外Song等[4]研究人员的研究有效地证明了通过口服弱毒疫苗免疫妊娠晚期母猪，可以很好地抵御PEDV的感染。Kweon等[5]研究人员用分离到的野毒株（命名为KPEDV-9），使之适应Vero细胞并连续传代至93代，用其免疫妊娠母猪，并进行ELISA检验，结果发现，母猪的免疫力明显提高，并且，新生仔猪对PEDV的野毒感染也有一定的抵抗能力。经过国内佟有恩等研究员、国外Song等研究员以及Kweon等研究人员在PED 弱毒疫苗上的研究，PED弱毒苗的研究已取得重大突破性进展。

弱毒株的优点有保护效果好、不需佐剂、特别是可诱导较强的细胞免疫反应，一次免疫即可获得长久免疫力。但是也有不容小觑的缺点，安全性有时难以确保；不易保存；此外免疫功能低下者接种可导致发病；成本高，有散度和返祖的危险，存在潜在感染的危险，很难在实践中推广应用。

3转基因植物疫苗

随着植物高效基因载体系统和遗传转化技术的发展，利用转基因植物生产动物基因工程疫苗用于动物疫病的防控已成为当前研究热点。感染发生的首要条件是病毒粒子表面纤突蛋白（S蛋白）与存在于肠上皮的细胞膜PEDV上的氨基肽酶（APN）的结合，因此，采用口服免疫是较为理想的预防途径。疫苗能刺激黏膜免疫，并能产生黏膜和血清保护性IgA抗体，是预防肠道传染病的有效途径。转基因植物作为口服疫苗有可能产生理想的黏膜免疫反应，从而达到预防病毒性腹泻的目的。

1983年，Fraley等首次将细菌基因导入植物细胞。1997年Awyam等进行了首例转基因植物口服疫苗的临床试验，为研制转基因植物疫苗提供了依据。2003年，韩国Bae等[6]将PEDV中和表位区域COE基因转入到烟草，构建了表达抗原的转基因烟草。利用表达的抗原口服免疫小鼠，试验结果表明能有效地诱导产生保护宿主细胞免受PEDV感染的体液和黏膜免疫应答。尽管在烟草中表达的PEDV 表位有抗原决定簇，但是外源抗原在烟草中表达水平低限制了转基因植物疫苗的发展。为此，2005年，Kang等[7]在无尼古丁的烟草中表达了合成的PEDV 中和表位基因，外源抗原的表达量占全部可溶性植物蛋白的2.1%，大约是天然基因表达量的5倍，为可食转基因植物疫苗的研究奠定了基础。目前，在以烟草花叶病毒为载体的无烟碱烟草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表达，用表达蛋白免疫接种后，对仔猪具有良好的保护作用，为PEDV转基因植物疫苗的研究奠定了基础。

对于肠道损伤为主的腹泻病毒，转基因植物疫苗或许具有安全可靠、成本低、使用方便、省时省力、生产简便、不需要冷藏和低温运输等优势，但抗原蛋白作为免疫原，其表达量处于较低水平，表达产物在植物中的稳定性差。转基因口服疫苗在产生免疫之前在胃肠道内有时被消化，确定饲喂量、有效剂量及抗原含量的稳定性都是没有解决的问题，大规模的提取和纯化需要进一步研究。

4乳酸杆菌疫苗

乳酸杆菌作为微生态制剂中的主要益生菌，广泛应用于食品、饲料加工业。构建乳酸杆菌质粒载体，表达在黏膜系统中增殖的病原微生物的保护性抗原基因，制备绿色环保、可食用的多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗应用前景广阔。而黏膜免疫恰恰是防治PED的主要途径。

近年来，研究人员成功构建了表达不同抗原的乳酸杆菌，口服这些乳酸杆菌后动物体内均能产生特异性黏膜免疫应答反应。2009年，胡桂学等[8]将已经构建完成的含有PEDV纤突蛋白COE基因的重组菌大量培养后，用1ng/mL乳链菌肽诱导，分别口服免疫断奶仔猪和妊娠母猪，用MTT法和间接ELISA法检测淋巴细胞转化情况和仔猪血清IgG、肠黏膜和妊娠母猪初乳中PEDV SIgA抗体水平。结果表明，口服重组乳酸菌仔猪与对照组相比，淋巴细胞增殖试验刺激指数差异显著、血清中IgG和SIgA 均明显增加，口服重组乳酸菌妊娠母猪乳汁中SIgA 较对照组显著升高。由于乳酸菌本身具有一定的免疫调节作用，因此此类疫苗在安全性和功效性方面有一定优势。

赵德等[9]将构建的PEDV重组乳酸菌经诱导表达后，经不同免疫方式接种小鼠，其中采用10倍稀释口服方式免疫小鼠产生的PED抗体水平最高，且刺激产生的血清IFN-γ水平也最高，该疫苗能够刺激小鼠产生体液免疫和一定的细胞免疫。葛俊伟等[10-11]先后构建了表达PEDV N基因和中和抗原位点的

2015

养猪SWINE PRODUCTION(4) 98