实验十二反相高效液相色谱法测定尼泊金酯

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实验六 反相高效液相色谱内标定量法测定尼泊金酯

预习提示

1. 液相色谱仪的基本结构及操作技术

2. 什么是反相液相色谱，反相高效液相色谱的分离特点是什么。

3. 相对校正因子的意义及测定方法

4. 色谱分析内标定量法的原理及操作要点。 一、目的要求

1. 熟悉高效液相色谱仪器基本结构及操作技术；

2. 掌握HPLC 保留值定性方法和内标定量方法。（了解定制报告编辑方法）。 二、基本原理

1. 高效液相色谱是以液体为流动相的色谱。其分离原理是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。

正相色谱体系是固定相的极性大于流动相的极性，反之亦然。

尼泊金酯（对羟基苯甲酸酯）混合物中含有尼泊金甲、乙、丙、丁酯，均属于强极性化合物，可用反相HPLC 进行分析，选用非极性的C 18烷基键合固定相，甲醇水溶液作流动相。

2. 色谱保留值法定性的依据在一定色谱条件下，每一种物质都有一个确定的保留值和它相对应。

3. 色谱定量依据

A m i i ∝

A f m i

i

i '

=

绝对校正因子 A

m f

i

i

i

=

' 不易测定

（相对）校正因子

A

A m m A m A m f

f

f

i

s s

i

s

s

i

i

s

i i

•==

=

'' 4. 对于试样中某一种或几种组分定量测定时可用内标定量法。

内标法要领：定量试样m 试样中加入定量内标物m s ，LC 分析后进行相对定量计算。 内标法定量计算公式：

)/(%ml ug A

A f

f V

m c is

i is

i s

is i •

•

=

内标物要求：试样中不存在的纯物质；加入量、理化性质、峰位置均与被测组分接近。

三、仪器、试剂

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1. 恒流泵 Series Ⅲ

2. 500型紫外检测器

3. 高压六通进样阀（20ul ）

4. 分析之星色谱数据工作站

5. 超声波发生器、砂芯过滤器

6. 进样器 1ml

7. 10ug/ml 尼泊金乙酯（对羟基苯甲酸乙酯）甲醇溶液，20ug/ml 尼泊金丁酯甲醇溶液，100ug/ml 苯甲酸甲酯甲醇溶液，备测试样。 四、实验条件

1. 色谱柱：250mm × 固定相：C 18烷基键合相 5um 。

2. 流动相：85%-90%甲醇水溶液，1ml/min 。

3. 检测器：紫外光度监测器，254nm ，灵敏度

4. 进样量 20ul 五、实验步骤

1. 将过滤配好的流动相装入试剂瓶中，开盖置于超声波发生器脱气15min 。

2. 按仪器操作规程打开数据工作站，据给定仪器条件启动HPLC 至基线平直。

3. 用甲醇清洗进样注射器、进样阀（10ml 容量瓶取甲醇适量，用干净的1ml 注射器操作）。

4. 定性实验 取干净10ml 容量瓶4只，分别取流动相和所给试剂尼泊金乙酯、尼泊金丁酯、

苯甲酸甲酯甲醇溶液和备测试样。

用干净的1ml 注射器取样～，排气泡，加过滤头，注入进样阀（LOAD 位），接着按仪器操作规程“10”进样操作。待试样出峰完毕，积分后记录被测组分保留时间。

5. 校正因子测定 取一干净10ml 容量瓶，用吸量管加入10ug/ml 尼泊金乙酯，100ug/ml 苯甲酸

甲酯，充分混匀，按上述方法注入色谱仪，待试样出峰完毕，积分后记录各相应组分峰面积A ，重复进样三次以上便于分别取平均值。

6. 试样中尼泊金乙酯和尼泊金丁酯定量测定 取一干净10ml 容量瓶，用吸量管加入试样，加入

内标标准溶液（100ug/ml 苯甲酸甲酯甲醇溶液），充分混匀，按上述方法注入色谱仪，待试样出峰完毕，积分后记录尼泊金乙酯和苯甲酸甲酯各相应组分峰面积A ，重复进样三次以上便于分别取平均值。

7. 选择典型试样加内标的色谱图保存，编制分析报告，打印色谱图。 8. 实验完毕按仪器操作规程停机，做好后处理工作。

六、数据处理

1. 根据实验记录数据计算尼泊金乙酯对苯甲酸甲酯的校正因子f wi

A

A m m f

i

s s

i

wi

•=

33

3. 根据实验记录数据计算试样中尼泊金乙酯的含量（mg/L ）

)/(%L mg A

A f

f V

m

c is

i is

i s

is i

•

•

= 4. 将所得色谱图附于“实验结果处理”后，并对应色谱峰标出相应物质的名称。

七、思考题

1.液相色谱仪的主要部件有哪些？试画出HPLC 流程方框图。

2.什么是反相液相色谱？按极性，化合物流出顺序如何？

3.液相色谱操作应注意哪些问题？

实验数据记录表（参考）

1. 定性测定记录表

标样保留值测定记录表

物质名称

t Ri /min

1

2 3 平均 尼泊金乙酯 苯甲酸甲酯

2. 校正因子测定记录表

峰序号 进样次序

1

2

t Ri /min A i /（×10n ）

t Ri /min A i /（×10n ）

1 2 3 平均

物质名称

尼泊金乙酯

苯甲酸甲酯

3. 定量测定记录表

4. 试样保留值测定记录表

峰序号

t Ri /min

物质名称

1

2 3 平均 1