基因工程大实验报告 (终稿)

内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文分类号: Q78编号:

本科生基因工程实验论文

纳豆激酶基因表达载体的构建及在

大肠杆菌中的表达

指导教师： X X X

学生： X X

专业：生物科学

年级：2009

2012 年8 月24 日

目录

摘要 ...................................................................................................................... .2 绪论 .. (3)

材料与方法 (4)

1材料 (4)

1.1试剂及仪器 (4)

1.2菌种 (5)

1.3质粒 (5)

1.4常用溶液的配制 (5)

2方法 (6)

2.1引物的设计 (6)

2.2 NK基因的PCR扩增 (7)

2.3 DH5a和BL21(DE3)感受态的制备 (7)

2.4 pMD19-T-NK的构建及转化和鉴定 (8)

2.5 pET-trx、pET-NK、pUC-Nk的酶切与回收 (9)

2.6 pET-trx-NK的构建及转化和检测 (11)

2.7 pET-trx-NK的诱导表达 (12)

2.8 pET-trx-NK表达的SDS-PAGE检测 (13)

结果 (15)

1. NK基因的PCR扩增 (15)

2. pMD19-T-trx的构建与鉴定 (16)

3. pET-trx、pET-NK、pUC-Nk的酶切与回收 (16)

4. pET-trx-NK的构建与检测 (18)

5. pET-trx-NK的诱导表达与SDS-PAGE检测 (19)

讨论 (20)

参考文献 (21)

致谢 (21)

感想 (22)

纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

摘要

纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶。经研究发现纳豆激酶具有纤溶活性和溶栓能力, 可治疗和预防血栓病。此外，纳豆激酶还具有降低血液黏度、降血脂、降胆固醇, 改善血液循环状况, 维持血细胞的正常形态和功能等作用。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作纳豆激酶基因，将已经连接在pMD18-T载体上的纳豆激酶酶源基因用PCR扩增出837bp的纳豆激酶的基因片段，与T载体连接后导入感受态的DH5α菌中筛选鉴定。用双酶切切下纳豆激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-trx，导入 BL(21)DE3感受态菌中诱导表达纳豆激酶蛋白质，用SDS-PAGE鉴定。

关键词：纳豆激酶，基因表达，载体，大肠杆菌

Constructing Expression Vector and Expressing nattokinase in E.coli

ABSTRACT

Nattokinase is a kind of subtilopeptidase. The study found that Nattokinase has activity of fibrinoltic which can treat and prevent thrombosis. In addition, Nattokinase can also lower blood viscosity, blood fat, cholesterol, improve blood circulation and maintain normal blood cells form and function and so on. Main of this article describe the gene engineering operation in nottokinase gene which has already connected with pMD-18-T vector amplified by PCR in which can get 837bp nattokinase gene fragments ,then linking with T vector that transform it into DH5α bacteria which wer e screened after identification. The mature peptide can be cutted by double-digested and insert with six histidine-tagged prokaryotic expression vector pET-trx. At last, induced the protein expression of nattokinase in the expression of E.coli BL (21) DE3. Eventually , identify that by SDS-PAGE.

KEY WORDS: nattokinase, gene expression, vector，E. coli

绪论：

纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种具有强烈纤溶活性的碱性丝氨酸蛋白酶[1]。纳豆激酶是食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产的分子量小的单链蛋白质。

由于纳豆激酶具有纤溶作用强，作用迅速，药效时间长；来源于食品，安全性能好，更易被人体消化吸收。可通过静脉与口服两种途径给药以及不引起出血的副作用等第一代溶栓药物所不具备的优点，使其具有开发成新一代溶栓药的潜力。

纳豆激酶于1987年由日本学者sumi在纳豆中发现。其成熟肽含有275 个氨基酸，分子量约为28ku，等电点为8.6±0.3。从纳豆中分离和纯化出一种蛋白激酶L这种酶具有很好的溶栓作用 , 是一种枯草杆菌的发酵产物,为丝氨酸蛋白酶类,称其为(nattokinase) L由275个氨基酸组成分子量为27kD,等电点为8.16±0.13L这种酶与其它溶栓药相比,除具有较强的溶栓作用外,还具有体内作用时间长,无毒无副作用等优点。

[2]我们用 PCR 方法克隆纳豆激酶基因，并重组到表达载体上进行了初步表达及表达产物的活性测定,为用基因工程菌生产纳豆激酶奠定基础。

经研究，纳豆激酶具有水解纤维蛋白的作用，它具有严格的限制性酶切位点，可直接作用于交联纤维蛋白，使其水解成可溶性的小分子，从而达到直接溶解血栓的作用。[3]提取纯化纳豆激酶，与交联的纤维蛋白酶解，发现不同时间降解交联纤维蛋白片段大小不同，出现1413kD、36kD、和41 kD不同大小的片段，从而白哦名纳豆激酶具有直接降解血栓的作用。纳豆激酶活体内尿激酶原转化为尿激酶，从而增加纤维酶的活性，进一步加强它的溶栓作用；纳豆激酶刺激血管内皮细胞产生内源t-PA，t-PA催化纤溶酶原转变纤溶酶，以使积累的纤维蛋白或血栓溶解；纳豆激酶通过降解好识货纤溶酶原激活剂的抑制剂（PAI-1）调控纤溶作用。[4]

纳豆中含有100种以上的酶, 碱性蛋白酶和A-淀粉酶易将纳豆中蛋白质分解便于人体消化吸收, 弹性蛋白酶( Elastase) 和植酸酶( Phytase) 目前已被从纳豆中提取生产应用于食品及其它工业中。[5]纳豆激酶具有防治心脑血管栓塞、抗致病菌、防癌、抗癌、阻止动脉粥样硬化、抗氧化、延缓衰老等多重作用，因此，纳豆激酶成为现在一项热点研究项目。

据统计, 目前美国每年有15万人死于中风，在我国，每年死于冠心病者约60万人，死于脑梗塞，脑溢血者120万人，约有80%病例是由于血栓引起而导致突发性恶果。[6]而纳豆激酶因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血管栓性疾病，与其他溶栓药物相比，具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可口服、半衰期长、生产价格低廉等优点，极有可能成为新一代李晓你哥的预防和治疗栓塞的新型药