巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展

中国生物工程杂志 Chi n a B i o techno l o gy ,2008,28(4):93~97

巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展

牟 琳1

王红宁

2*

邹立扣

1

(1四川农业大学生命科学学院 雅安 625014)

(2四川大学生命科学学院动物疾病防控生物工程研究中心 成都 610064)

摘要 巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的分泌型基因工程宿主菌,现已广泛应用于工业和学术研究领域,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。综述了其自身的优点、表达载体的特点、巨大芽孢杆菌的转化方法、外源蛋白的表达、高效表达的策略以及表达系统的应用。

关键词 巨大芽孢杆菌 外源蛋白 高效表达

中图分类号 Q789

收稿日期:2007 11 24 修回日期:2007 12 27

*国家 十五 重点科技攻关资助项目(2002BA514A 12)**通讯作者,电子信箱:w hongn i ng @163.co m

巨大芽孢杆菌表达系统是一种很好的表达外源基因的系统。由于其分布广泛,生化功能多样,以及能表达、分泌、加工外源蛋白而不降解外源蛋白,巨大芽孢杆菌越来越多地作为表达外源基因的宿主菌,在工业以及学术研究领域得到了广泛的应用。

1 巨大芽孢杆菌概述

巨大芽孢杆菌体型巨大,超过60 m 3

(2.5!2.5!10),是大肠杆菌体积的100倍以上[1]

。其能依靠多种

碳源生长,因而分布十分广泛。同时,巨大芽孢杆菌能

降解一些顽固的难降解的杀虫剂[2,3]

,因此对环境具有

十分重要的作用。

一些巨大芽孢杆菌的蛋白质具有重要的作用。例如:其细胞色素P 450单加氧酶系同真核细胞色素P 450单加氧酶系相似,在许多疾病中发挥着类似的作用。另外,在工业上,巨大芽孢杆菌分泌的酶应用也十分广泛,如淀粉酶应用于面包生产、青霉素酰胺酶应用于合成新型人工抗生素等。很多基因在该菌中都得到了较好的表达及分泌。

2 巨大芽孢杆菌在表达外源蛋白中的优点

2.1 能利用多种碳源

巨大芽孢杆菌能利用多种碳源,营养要求低,生长

快。在许多生态环境中都存在着巨大芽孢杆菌,例如肉类加工厂的废弃物中,石化产品的排出物中都有巨大芽孢杆菌,另外,巨大芽孢杆菌在28~37∀都能很好地生长,它的这些特点能有效降低培养成本,便于工业化生产。

2.2 蛋白质表达产量高,稳定性好

与其它芽孢杆菌相比,巨大芽孢杆菌不具有碱性

蛋白酶,表达的外源蛋白不会被降解,重组质粒稳定,不易丢失[4]

。此外,巨大芽孢杆菌细胞壁的组成简单,只含有肽聚糖和磷壁质,因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有内毒素(热源性脂多糖),因此外源蛋白产量大,适用于工业大规模的蛋白质生产。2.3 分泌量大且分泌的蛋白易纯化

在巨大芽孢杆菌中表达的蛋白既可以存在于胞内,又可以存在于胞外。由于其只有一层细胞膜,因而可以大量分泌蛋白至培养基中,蛋白跨越细胞膜后,被加工和直接释放到培养基中以活性结构生成而不发生聚集,避免了复性的困难[5]

。产物与大量的细胞蛋白分离,回收和纯化蛋白较为简单。

2.4 良好的发酵基础和生产技术

巨大芽孢杆菌发酵工艺和产物回收技术较成熟,用作外源蛋白的分泌型宿主菌,具有很大的潜力。巨大芽孢杆菌在工业上被用于生产蛋白酶、 淀粉酶等。在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。细胞的生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究。

中国生物工程杂志China B i o techno logy Vo.l28No.42008

3 巨大芽孢杆菌表达载体

表达载体包括启动子、外源基因克隆位点、分泌信号、终止子、筛选标记、复制起点、信号肽序列等。为了便于操作,用于转化适合巨大芽孢杆菌宿主细胞的表达载体均为大肠杆菌和巨大芽孢杆菌的 穿梭质粒[6],先在大肠杆菌中复制扩增,然后被导入巨大芽孢杆菌宿主细胞。它是由来自巨大芽孢杆菌的部分基因序列和大肠杆菌的部分基因序列所组成。其大肠杆菌部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起始序列(ori)和特定的抗性基因序列。这两部分主要是作为在大肠杆菌宿主中的增殖和筛选组分。巨大芽孢杆菌部分包括:巨大芽孢杆菌转化子的筛选组分以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。后两者之间为多克隆位点。

现在使用得比较普遍的载体是pH I S1522和pH I S1525,它们都来源于Rygus和H illen的p WH1520载体[7,8],是由芽孢杆菌质粒pBC16和大肠杆菌质粒pBR322两者构成的穿梭质粒。下面将简述载体pH I S1522和P H I S1525的特点。

3.1 木糖启动子

1991年,Rygus与H ille n发现了位于巨大芽孢杆菌基因组上的木糖诱导的启动子Pxyl A。在木糖存在情况下,木糖异构酶基因xyl A在Pxyl A控制下的表达比木糖不存在时提高了200倍[9]。在重组质粒上采用木糖启动子,在木糖存在情况下,目的基因在巨大芽孢杆菌中的表达比加入木糖之前能提高130~350倍[10]。 利用木糖启动子诱导基因表达的机理是:在木糖存在的条件下,木糖阻遏子会从启动子上释放出来从而使转录开始。这使外源蛋白在巨大芽孢杆菌中的表达得到了很好的调控[10]。目前,木糖启动子系统已被成功地用于许多异源原核及真核蛋白在巨大芽孢杆菌中的胞内或胞外表达[9,11~15]。

3.2 多克隆位点和组氨酸标签

在木糖启动子的下游,具有多克隆位点,包括Bam H I、Sac I、Kpn I等共15种限制性内切酶的酶切位点,方便目的基因的插入。载体p H I S1522和p H I S1525的多克隆位点有所不同。多克隆位点下游具有组氨酸标签,能编码连续的6个组氨酸,易于目的蛋白的纯化和探测。

3.3 抗性基因

载体p H I S1522和P H I S1525分别具有两种抗性基因:氨苄抗性基因和四环素抗性基因。其中,氨苄抗性基因属于大肠杆菌中的筛选组分,四环素抗性基因则属于巨大芽孢杆菌中的筛选组分。这种载体存在的一个弊端就是抗性基因的释放会产生耐药性菌株,存在着安全隐患,这也是许多基因工程所用载体共有的一个弊端。近年来相关研究者也提出了一些提高标记基因安全性的策略:利用无争议的生物安全标记基因,例如绿色荧光蛋白基因等;利用无选择标记基因的转化系统等。

4 巨大芽孢杆菌的转化

巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,其转化方法与大肠杆菌等革兰氏阴性菌不同,一般有原生质体转化法和电击转化法。

4.1 原生质体转化法[16]

巨大芽孢杆菌的原生质体转化法是由P EG 6000介导的。首先需要溶菌酶的作用将巨大芽孢杆菌处理为原生质体,继而将构建好的携带外源基因的质粒转化进巨大芽孢杆菌中。当质粒进入巨大芽孢杆菌原生质体中后,需要再生培养基使其形态功能恢复,同时需要筛选培养基对转化子进行筛选。因此原生质体转化法比较复杂。

4.2 电击转化法

对于革兰氏阳性菌巨大芽孢杆菌来说,电击转化法是最简单快速且转化效率高的一种转化方法。电击转化芽孢杆菌虽没有像大肠杆菌一样的转化效率,但此方法能有效地将DNA引入巨大芽孢杆菌中。

A leja ndr o等[17]用电击转化短芽孢杆菌时,发现在电压6000V到15000V的条件下都能转化成功,随着电压的提高,存活率从92%下降到58%,转化率从1.5 !101上升到5.87!103转化子/ g DNA。

5 外源蛋白在巨大芽孢杆菌中的表达

5.1 信号肽

外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定途径分泌至细胞外。几乎所有的分泌蛋白在合成时都带有信号肽,信号肽在其分泌过程中发挥重要的作用: (1)促进新生蛋白的折叠;(2)是转运元件识别和连接的靶子;(3)与转运成分相互作用,介导蛋白多肽的转运。 芽孢杆菌分泌蛋白的信号肽与大肠杆菌的一样,也由N区(带正电荷),H区(8个以上疏水残基)和C 区(极性氨基酸)三部分组成。但前者信号肽的N区通

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