激光捕获显微切割操作方法

激光捕获显微切割激光捕获显微切割（（laser capture microdissection LCM laser capture microdissection LCM））

操作方法操作方法

蛋白质组学是当今肿瘤学研究领域中的一个热点，而“差异”蛋白质组学又是蛋白质组学研究的一个突破口。在有关“差异”的研究中，若原始样品不是分别来自同一类型，或样品存在着杂质蛋白的污染，那么所得实验数据的准确性和说服力必然会受到影响[1]。众所周知，人体组织器官是多种细胞的复合，肿瘤组织的不均一性是肿瘤细胞的重要特征。因此，如何从复杂、不均一的样品中获得理想的高同质性的组分成为实验中亟需解决的主要问题之一。激光捕获显微切割（laser capture microdissection LCM）技术的出现为上述问题提供很好的解决方案。该方法的突出特点是能在目视下从样品中特异挑选同类细胞乃至单一细胞；从而

剔除间质细胞和坏死及其他可能影响结果分析的杂质成分[2]。

本研究应用LCM 针对不同类型组织标本，选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞；以期探讨该方法在肺癌研究中的技术参数和操作流程。

1 材料与方法

材料与方法 1.1标本的收集及制备标本的收集及制备 收集西安交通大学医学院第二附属医院胸外科、

陕西省人民医院胸心外科、陕西省肿瘤医院胸外科2005-2006年经病理诊断证实的手术切除肿瘤标本12例，其中肺鳞癌6例，肺腺癌6例，正常对照组织为同一患者正常肺组织。12例患者中男性8例，女性4例；有吸烟史者5人，平均吸烟指数1900支/年；肿瘤分期：I 期2例、II 期7例（IIA3例，IIB4例）、III 期3例。所有病例标本均在手术室采集，具体操作如下：待组织标本离体后立即切取肿瘤组织，同时切取正常对照组织；用4℃冰盐水冲洗3—5次，将血液冲净，均匀

分割成0.2cm×0.2cm×0.2cm大小；分装于标志清楚的0.5mL离心管中；先置液氮中速冻，后置于-80℃冰箱保存备用。整个标本采集过程耗时控制于30min内。

试剂和仪器 苏木精、伊红、无水乙醇、二甲苯、尿素等均为国产分析纯。

1.2 试剂和仪器

组织包埋剂（OTC）；冰冻切片机（Microm，HM500）；超低温冰箱（Thermo Forma -86℃)；Pixcell显微激光切割系统（Arcutuous，USA）及乙烯乙酸乙烯酯膜帽子细胞收集器（EVA LCM Caps）。

方法

1.3方法

冰冻切片制备及染色 预处理载玻片（将普通载玻片清洗干净，流水冲洗后1.3.1冰冻切片制备及染色

泡酸过夜，双蒸水冲洗干净，60℃烘干备用）。取0.2cm×0.2cm×0.2cm 大小组织两块，OTC包埋，待组织包埋固定完全，将切片机箱内温度设置为-25℃进行切片，切片厚度8um，每次连续制作15张切片，-80℃保存备用。两组肿瘤组织和对照各6例，每例患者制作切片15张。取制作好切片进行H-E染色，方法如下：苏木精10s，捞片置于冰水冲洗10s，伊红15s，85、95乙醇各20s，无水乙醇2min，2次，二甲苯I 4min，二甲苯II 2min。上述染色过程在冰盒中进行，染液温度控制于4—10℃，总时间控制在8 min以内。完毕后进行激光捕获。

激光捕获获将染色完好切片置于Pixcell显微激光切割系统10×10倍目镜直1.3.2 激光捕

视观察，重点观察细胞形态和染色情况。找到细胞密集、形态较好、染色满意区域，装载细胞收集器；在10×20倍目镜下调节监视器，按照如下条件：Power 100mV、Duration 15.5s、Spots size 15.5um、Current 8.0mA，每张切片平均8000shots 条件进行捕获。总捕获时间不超过40min 。

结果

2结果

切片按照改良的HE方法染色后，均能获得细胞形态完整、对比度好、肿瘤细胞和间质可清楚区分的合格切片；在设定捕获条件下，每张切片捕获后能够将90以上的细胞收集，细胞同质性高（见图1）。按照理论测算，每个shots可以捕获4-6个细胞，即每个帽子收集装置可以获得25000-30000个细胞数。

讨论

讨论

3.3.讨论

肺脏是一个开放器官，容易受到外界污染，加之肺癌组织含有较多间质细胞而且容易坏死。因此，按照传统方法进行组织块研磨提取总蛋白进行分析，结果难免会受到杂质蛋白的影响。LCM技术现已成为蛋白质组学研究中获得纯化的目的细胞的理想工具，其在实体瘤研究中应用较多，技术方法亦日臻成熟[3-5]。但据文献报道，该法主要用于核酸分子以及染色体研究，在肺癌组织蛋白组学研究领域鲜见[6]。本研究应用LCM技术切割不同类型肺癌组织，获得250个帽子收集装置和8.7×106 个细胞数。从捕获操作过程中我们发现，捕获细胞的同质性、细胞收集率以及操作过程所耗费时间是影响激光捕获及后续蛋白质组学实验结果的关键因素。由于LCM是在直视下操作，细胞纯度可以保证。经随机抽取3组、45个帽子收集装置，使用Pixcell II显微激光切割系统内标记尺划分观察视野，抽样估算收集装置内细胞同质性可达到95以上，该结果与文献报道一致[7]。当然，文献报道最多的是关于基因和分子水平的研究，但其中的切片制作和LCM切割部分是相同的。Pixcell II显微激光切割系统是新一代系统，该系统的优点是使用的是乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽（ethylene vinyl acetate caps，EVA caps）细胞收集装置，可避免操作者手接触所收集到的细胞，减少污染机会。EVA膜需要和细胞紧密接触才能够被激光束融化而将目标细胞收集，因而LCM过程受很多因

素影响而不能保证将每个捕获细胞均能收集。激光捕获仪主要参数有：Power、 Duration、 Spot size、 Repeat 及Current等。一般在打开系统进行切割之前，应先在帽子空白区空打5—6次，观察激光能量，光点大小是否合适，以光点能够完全覆盖目标细胞为宜。本实验中所选择条件是：Power 100mW、 Duration 15.5ms、 Spot size 7.5-15um、 Repeat 0.2s、Current 8.0mA。Zhukov等[8]应用LCM 切割肺癌组织时认为，鳞癌可选择7.5&mum激光束，腺癌中用15&mum，可获得较好效果。在本实验中，我们发现激光束的大小与鳞癌和腺癌组织类型关系不明显，但与切片的制作和捕获操作过程关系较大，切片的厚度、脱水时间和EVA 膜是否和细胞紧密接触是重要影响因素。制作切片时应将切片厚度控制于

8-9&mum，以8&mum效果最佳，超过10&mum因切片过厚则细胞发生重叠从而使细胞收集困难，同时要注意不能使切片产生褶皱，造成切片表面与EVA膜之间存在缝隙，影响捕获效果。在HE染色步骤中，二甲苯疏松时间、组织含水量及环境湿度等均可影响捕获结果。二甲苯疏松时间不足可出现细胞较难从周围组织分离。对环境湿度和组织含水较多者应及时更换染液，适当延长乙醇的脱水时间。但过分延长脱水时间则使组织变的干燥松脆，出现帽子与切片不能紧密接触而无法捕获。在实验过程中梯度乙醇的最长脱水时间为2min。乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽（EVA caps）应置于4—10℃、干燥环境妥善保存。如帽子受潮，则激光激发能量可被乙烯乙酸乙烯酯膜大部分吸收而非穿透，致使帽子与组织接触局部温度升高，产生组织和捕获细胞灼伤。从肿瘤组织类型看，腺癌的捕获收集成功率最高，可以达到91；鳞癌相对较差，可能与鳞癌多有癌巢及角化珠形成、癌细胞与间质结合较为致密有关。考虑到正常肺泡及支气管上皮细胞体积相对较小、细胞分布相对稀疏，故正常对照组应多捕获约10个帽子，以保证病例和对