利用聚乙二醇(简称PEG)为媒介物进行细胞融合

细胞生物学实验报告

题目：利用聚乙二醇（简称PEG）为媒介物进行细胞融合

姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科3班

时间：2011/3/10

一、【实验目的】

1、了解细胞融合的基本原理。

2、掌握利用聚乙二醇（PEG）为介导物对各类细胞的融合方法。

二、【实验材料】

试剂：

1、Alsver液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，溶于100ml

双蒸水中。

2、0.85％生理盐水

3、GKN液：

NaCl 8g、KCl 0.4g、Na2HPO4·2H2O 1.77g、Na2HPO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红（phenolrad）0.01g，溶于1000ml蒸馏水中。

4、50％PEG液：

实验前临时配制，根据需要称取定量PEG（Mw=4000），放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃等体积的GKN液，混匀。

器材：

显微镜，离心机，水浴箱，离心管，滴管，载玻片，盖玻片

三、【实验原理】

细胞融合(cell fusion)是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多

核细胞的现象称为细胞融合,结果产生杂交细胞(hybrid)，亲本相同的融合细胞称为同核体(homokaryon),反之称为异核体(heterokaryon)。

当前普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。

本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为：1.鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2.实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。

四、【操作步骤】

1、取鸡血2ml和2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后制悬液（可在4℃保存）

2、取（1）中溶液1ml加上4ml 0.85％的NaCl溶液，混匀后1200r/min离心5分钟，去除

上清液。

3、取上步剩余的沉降血球（约0.1—0.2ml），加入GKN液至1—2ml，使之成10％的细胞悬液。

4、取上述10％的血球悬液1ml，加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000万个，即1.5x108个/ml。

5、取（4）中血球悬液0.5ml和0.5ml 50％的PEG液于一新离心管内，置于水浴锅，作用2~3min，用吸管吸取半滴该悬液，滴片，显微镜下观察。

五、【试验结果及绘图】

阶段一：两细胞接触，粘连；

细胞膜形成穿孔；

(10x40)

阶段二：两细胞的细胞质连

通；通道扩大，两细胞连成

一体；

(10x40)

阶段三：细胞完全合并，形

成一个含有两个核的细胞。

(10x40)

六、【结果分析与讨论】

在镜检过程中发现，视野中处于融合状态的细胞数目较少，即细胞融合率较低。经过分析与查资料得出影响细胞融合率的因素，如下：

1、PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。

2、PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。

3、PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。

4、融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。

结合实验情况，总结出最有可能的是第三条和第四条因素，即反应的温度和时间。由于实验当天温度较低，而且操作时是按照老师板书上所写“2~3min”所

做，故有可能导致PEG的作用不完全，从而使得细胞融合率下降。

附：

细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩大。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。如：

制备单克隆抗体：使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体(monoclonal antibody ,McAb) 的杂交瘤细胞。单克隆抗体具有专一性和灵敏性。作为理论研究的工具在病原检测和疾病治疗以及食品安全领域具有广阔的应用前景。1985 年,中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体,同时还与有关医学部门合作,成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。在神舟四号上我国自制的细胞电融合仪分别进行了植物细胞的电融合试验和动物细胞的电融合试验,动物细胞电融合实验采用纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞,目的是获得乙肝单克隆抗体。目前有关单位利用McAb 作用的专一性这一特点正在探索用“生物导弹”对癌症进行早期诊断和治疗。

其具体应用有如下几个方面：

1．检验医学诊断试剂

作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：

①病原微生物抗原、抗体的检测；②肿瘤抗原的检测；③免疫细胞及其亚群的的检测；④激素测定；⑤细胞因子的测定。

单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。

2．蛋白质的提纯

单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。

3．肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术

将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。目前单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人-人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。