噬菌体的检查研究方法(一)

噬菌体的检查研究方法(一)

【摘要】噬菌体在普通显微镜下看不到，在电子显微镜下有四种外形，即有尾(均有一立方对称的头及螺旋对称的尾)、立方体(无尾，衣壳为立方对称)、丝杆状(无头尾区别，呈螺旋对称)，和多形性(有包膜无衣壳)。大多数噬菌体由头部和尾部组成。例如大肠杆菌T4噬菌体头部呈六边形，立体对称，大小约95×65nm，内含遗传物质核酸；尾部是管状器官，长95～125nm，直径13～20nm，是由一个内径约2.5nm中空的尾髓和外面包着的尾鞘组成。尾髓具有收缩功能，可使头部核酸注入宿主菌。在头和尾连接处的颈部还有一个颈圈结构，颈圈有六根须。尾部末端有尾板、尾刺和尾丝。尾板内可能有使宿主菌细胞壁裂解的溶菌酶。尾丝为噬菌体的吸附器官，能识别宿主菌表面的特殊受体。【关键词】噬菌体检验

一、噬菌体的分离

所有样品必须是液体。土壤和其它污物可悬于适量液体培养基中。为了易于分离，可以预先经过培养，使样品中的噬菌体数量增加，这一步称富集。其方法是将2～3g土样或5ml水放入灭菌三角瓶中，加入对数生长的敏感指示菌3～5ml，并补加培养基20～25ml，在适宜温度下振荡或静止培养过夜。如果样品中有噬菌体，将随细菌的生长繁殖而使噬菌体数量增多，因而达到富集目的。需要定量检查相对噬菌体时，应该省略上述操作，直接进行分离。将上述样品液以3000r／min 离心或通过微孔滤膜(孔径0．45μm)除去杂菌。有的实验室采用氯仿消

除杂菌，即在样品上清液中加入1／50～1／10体积氯仿，混合，涡动，保温1h后取上清液。这种方法仅对氯仿不敏感的噬菌体适用。取消除杂菌后的上清液用肉汤或缓冲液，经适当稀释后用双层或单层琼脂法检查。

二、溶原性细菌的检查

(一)自发释放噬菌体的菌株检查

许多细菌自发释放噬菌体，其频率为10-2～10-5。从溶原菌中分离噬菌体，首先必须排除由噬菌体本身所携带的游离噬菌体，其次是选择足够数量的相近菌株。测定所释放的噬菌体，关键是选择敏感指示菌，才能在指示菌的菌苔上形成噬斑而加以区别。缺适宜的指示菌就不能获得噬斑，也无法判断是否释放噬菌体和作出结论。

1．先在平板上挑选典型单菌落，在生理盐水制成悬液，振荡分散细胞，在3000r／min离心30min，弃去上清液，重悬在生理盐水中，离心洗涤三次，取沉淀物适当稀释后，涂布在平板上，获得单菌落，连续洗涤三次的目的是脱除所携带的噬菌体。

2．取上述处理的菌株培养物，按1％的接种量接入10ml培养基的三角瓶中，在适宜温度(因菌不同而不同)下振荡培养2．5～3h，或静止培养过夜14h。

3．取对数生长的敏感指示菌培养物0.2ml和稀释的上清液0.1ml混合。用双层或单层琼脂平板，铺展上述混合物。在适宜温度下培养。4．凡出现噬斑的菌株，可证明该菌株是溶原性菌株；未出现噬斑的菌

株：还不能确定为非溶原性菌株，可能需要寻找适当的指示菌，再经过测定才能得出正确结论。

(二)经诱导产生噬菌体的菌株检查

有些溶原菌以极低的频率产生噬菌体，而利用常规方法无法检测。如果利用紫外线或丝裂霉素C诱导，可明显提高噬菌体产生的几率。

紫外线诱导操作程序：

1．取对数生长的细菌悬液(5×108／ml)，经缓冲液洗涤，重悬在缓冲液中，配成108／ml。将5ml悬液放入带有一微型转子的直径9cm小皿中。

2．小皿放在电动搅拌器上，距离15W紫外线灯管30cm处，灯管应事先启动30min后再照射。

3．在蔽光下开动搅拌器进行照射，以5s，10s，20s，30s，40s，50s 和60s计时照射。

4．取出4ml照射液，加入1ml5倍浓缩培养基混合。移入所需温度振荡培养数小时，遮光。