脑梗死小鼠凋亡神经元及脑血管内皮细胞超微结构的观察

脑梗死小鼠凋亡神经元及脑血管内皮细胞超微结构的观察

李振光,伍期专,姚存姗

(北京医科大学第一医院神经生化室,北京　100034)

摘要:目的　观察脑梗死后不同时间点脑组织的病理变化,尤其是凋亡神经元及血管内皮细胞超微结构的改变。方法　采用经皮光化学脑梗死模型,氯代三苯基四氮唑(TTC )染色,光镜及透射电镜观察。结果　缺血24～48h ,脑组织及血管内皮细胞损伤最严重,缺血6h 至1个月均可见凋亡神经元,其中以48h 最多见。早期应用巴曲酶对缺血脑组织及血管内皮细胞有保护作用。结论　脑缺血后神经元在相当长的一段时间内均可发生凋亡。保护血管内皮细胞、抑制神经元凋亡对改善缺血脑组织的预后具有重要意义。关键词:脑梗塞;小鼠;细胞凋亡

中图分类号:R 743.33 文献标识码:A 文章编号:1009-0126(2000)02-0128-04

Long -term observation on ultrastructure of apoptosis of neuron and

endothelial cells of cerebral vessels in mice with photochemically

induced cerebral infarction

LI Zhen -guang ,WU Qi -zhuan ,YAO Cun -shan

(Labo rato ry of Neu rochemis try ,First Affiliated Hos pital ,Beijing M edical University ,Beijing 100034,China )

A bstract :Objective To investigate the cerebral pathological changes at different time points after brain in -farction ,especially the changes of the ultrastructure of apoptosis of neuron and vascular endothelium .Methods The transdermically photochemically induced cerebral infarction model was used .TTC (2,3,5-triphenyl -tetrazolium chloride )staining ,light and transmission electron microscopy were chosen to investigate the chang -es .Results The dama ge of brain tissue and vascular endothelium was most prominent from 24to 48hours af -ter brain infarction .The apoptosis of neuron could be found from 6hours to 1month after brain infarction ,and

was found most frequently at 48hours .The administration of batr oxobin protected the brain tissue and endothe -lium at the early stage of cerebral ischemia .Conclusion The apoptosis of neuron could occur during a rather long period and the time window of inhibiting ischemic apoptosis is r elative long .The pathomorphism of isch -emic brain could be seriously influenced by endothelium .Key words :cerebral infarction ;mice ;apoptosis 收稿日期:1999-10-23

作者简介:李振光,男,1965年9月生,硕士,主治医师,现在山东省

文登中心医院神经生化临床应用重点实验室,山东威海,264400

近年来,许多研究结果表明,细胞凋亡参与了脑缺血后的再灌注损伤,特别在迟发性神经元死亡中发挥着重要的作用

〔1〕

。但对于局灶性脑梗死后神经

元凋亡的生化及形态学研究,目前多局限于对缺血后某一时间的研究,缺乏长时间的观察〔2,3〕

。血管内

皮是一重要的功能性界面,目前对脑梗死的研究多集中在神经元的损伤及血液成分的改变等方面,而

对于血栓形成的另一重要因素即血管因素的研究较少。目前,临床上已经对缺血早期应用溶栓药物持肯定态度,认为其机制,主要是作用于凝血系统,但其对缺血后神经元及血管内皮细胞形态学方面的作用和影响尚不清楚。我们在光化学脑梗死鼠模型的基础上,对脑缺血后凋亡神经元及血管内皮细胞超微结构的变化进行了长时间的动态观察,并以巴曲酶(batroxobin )为代表,研究溶栓药物的影响。

1　材料和方法

1.1　局灶性脑梗死动物模型的制备　在Watson

等〔4〕模型基础上加以改进,采用经皮光化学诱导方法。以冷光灯作为光源,高速风扇降温,透镜聚焦后,滤光片滤光,投射出单一绿色光束。于鼠脑上安放用避光纸制作的透光孔,孔径0.6cm×0.7cm,采用玫瑰红B(四碘四氯荧光素二钠,分析纯,北京化工厂生产)作为化学诱导剂。小鼠给予2%戊巴比妥钠(50mg kg体重)腹腔注射麻醉,剪掉照射野区域毛发,硫化钠脱毛,尾静脉注射玫瑰红B(60mg kg 体重),经皮照射小鼠右侧额顶部20min。

1.2　动物分组及行为学观察　昆明小鼠,体重20～23g,北京医科大学动物中心提供。随机分成11组,其中巴曲酶组10只,余每组6只。对照组分为: (1)未经任何处理组;(2)单纯光照组:不注射光敏剂,单纯光照20min;(3)单纯光敏剂组:注射玫瑰红B,不光照。实验组:注射玫瑰红B后光照20min,分为脑梗死后6h、24h、48h、1周、2周、1个月、2个月7个不同时间的亚组。巴曲酶组:于诱导后30 min尾静脉注射巴曲酶(日本东菱药品工业株式会社产品,5B U kg体重),分别于诱导后6h、24h、48h 进行病理学观察。各组均于诱导结束后2h观察小鼠行为,并参照Bederson等〔5〕方法进行神经系统评分。

1.3　病理学观察　脑大体病理学观察采用TTC染色法:断头取脑后,沿冠状面切取2mm厚脑片,置2%TTC溶液中37℃避光染色30min,正常脑组织染成红色,梗死脑组织呈白色。进行光镜及电镜观察的小鼠均经戊二醛多聚甲醛磷酸缓冲液内固定处理。断头取脑后于梗死中心及边缘区各切取1m m ×1mm脑组织块,置3%戊二醛溶液中过夜固定后,四氧化锇重固定,环氧树脂包埋,半薄切片病灶定位,制成超薄切片,铅铀双重染色,透射电镜观察。剩余脑组织转入4%多聚甲醛溶液中再固定,石蜡切片,HE染色,光镜观察。

1.4　统计学处理　应用SPSS软件进行统计学处理,计数资料采用χ2检验(Fisher正交测试)。

2　结　果

2.1　体征及神经系统评分　对照组小鼠于光照或注射玫瑰红B后1～2h从麻醉状态恢复正常,无神经系统体征。实验组小鼠于光化学诱导后均出现神经系统症状或体征。巴曲酶干预组神经系统体征明显减轻(P<0.01)。评分结果见表1。

2.2　病理学观察

2.2.1　一般病理学改变　脑梗死后6h组:光镜显示血管内血栓形成,神经细胞及小血管周围间隙扩大。电镜显示神经元线粒体肿胀呈空泡状,内质网扩大,核糖体脱落,神经元周围星形胶质细胞突起肿胀。24～48h组:光镜显示明显的缺血坏死区,血管及神经细胞周围间隙进一步扩大,提示脑水肿加剧。电镜显示部分神经元胞浆中有空泡形成,核染色质固缩;胶质细胞线粒体肿胀或皱缩,内质网扩大,可见明显髓鞘分层现象。1～2周组:光镜下神经细胞及血管周围间隙减小,病灶中央区组织崩解破坏,出现大量泡沫细胞。电镜下部分神经细胞线粒体仍呈空泡状,可见吞噬细胞。1～2个月组:光镜下中央坏死区液化形成空腔,周边囊壁形成。电镜显示胶质纤维增加,神经毡内仍见透亮空泡,吞噬细胞存在。对照组光镜及电镜均未见异常。

表1　经皮光化学诱导小鼠脑梗死后神经系统评分

(例数,%)

组别例数0级1级2级3级

对照组1818(100)000

实验组4204(10)31(74)7(17)

巴曲酶组101(10)7(70)2(20)0

注:显著性检验比较实验组与巴曲酶组,结果表明应用巴曲酶可使神经系统评分明显降低(P<0.01)。

2.2.2　血管内皮细胞的改变及巴曲酶的作用　缺血6h组:可见血管内皮细胞明显肿胀,空泡形成(图1)。部分内皮细胞线粒体肿胀或空泡化,粗面内质网扩张,核糖体脱落。缺血24～48h,内皮细胞肿胀进一步加重,核染色质固缩。缺血1～2周,内皮细胞肿胀减轻,部分内皮细胞核突入管腔,致管腔极度狭窄(图2)。巴曲酶组血管内皮细胞肿胀不明显,细胞器结构相对完整(图3)。此外,巴曲酶组血管及神经细胞周围间隙缩小,神经元结构相对完整,细胞器无明显肿胀(图4)。髓鞘脱失现象不明显。

2.2.3　凋亡神经元超微结构的改变　缺血6h、24

h、48h、1周、2周及1个月6个组均观察到凋亡神经元的存在,其中以24～48h组较多见。凋亡细胞大多分布于缺血的边缘区,并常散布于正常神经元中间,缺血中心区少见。其形态表现为整个神经元呈浓缩状态,胞核、胞浆深染,细胞体积缩小。电镜下处于凋亡早期的神经元表现为核染色质聚集成块,并聚集于核周,形成不规则的染色质环,环内为电子密度低的核质,核膜完整(图5)。处于凋亡早期的神经元胞浆浓缩,线粒体、内质网等细胞器及胞膜结构完整。至凋亡晚期,染色质常完全聚集在一起,形成一大的高电子密度的染色质团块,继之神经元核裂解成核碎片,形成大小不等的有完整膜包裹的凋