6、大肠杆菌菌浓的测定及发酵罐实验的了解

通用发酵罐的基本结构
在你所见到的实 验室发酵罐上是 否找到对应功能 的部件？
发酵罐实物图



控制主机 罐体 通气系统

空压机、通气管、流量计… 电机、搅拌桨、挡板… 升温、降温 pH、温度、溶氧、泡沫…


搅拌系统


控温系统


传感器

补料系统 消泡系统 取样口、接种口
发酵实验的一般操作过程



准备菌种（大肠杆菌） 准备培养基 校准电极（pH、溶氧…） 发酵罐（含培养基）灭菌 接种 发酵及取样分析（~24h） 下罐
发酵取样记录表格
标号 发酵时间(h) 取样体积(ml) 稀释倍数 OD600 菌浓 (g/l)
实验报告内容

OD600与菌体干重的关系曲线 画出实验室发酵罐的示意图（包括主机、
实 验 六
大肠杆菌菌浓的测定 及发酵罐实验的了解
目的要求



学习比浊法测量细菌数量的方法； 学习空气浴摇床的使用方法； 学习分光光度计和离心机的使用方法； 掌握菌浓和菌体干重关系曲线的测定方法； 了解通用发酵罐的基本结构。 了解发酵罐实验的一般流程及注意事项。

微生物生长曲线的测定
心效果与转速、时间的关系
【实验内容】


1. 离心管称重
将一干净15ml 离心管，用分析天平准确称重并记录。


2. 菌液离心
将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，准确吸取菌液10ml加至已称 重的离心管内(取液前将培养液振荡，使细胞均匀分布) 。与 另一加水的相同离心管进行配平。8000rpm离心5min，弃去 上清，加去10ml离子水重悬菌体，离心。再重复上述洗涤操 作 1次。弃去水溶液，将带有菌体的离心管在 80℃ 烘干至恒 重。准确称重并记录。
比浊法 干重法 菌落计数法 血球计数板计数法 …

菌浓OD600与菌干重的对应关系

将大肠杆菌用LB培养基进行培养，在快速生长中期取样，分别用 去离子水（新鲜LB培养基）稀释至不同浓度，分别测定 OD600值。 同时取10mL菌液，8000rpm离心5min后，弃菌液，并用无菌水重 悬洗涤、离心2次， 80℃下烘干至恒重后，测得干重。 菌浓与OD600的对应关系如下图所示。 经数据拟合，线性良好。
仪器和其它物品： 722 型分光光度计，空气浴振荡摇床，离心机，比色皿， 试管，移液器、枪头、离心管等。 上次灭菌的肉膏蛋白胨液体培养基。 发酵罐



发酵培养基 发酵菌种 火圈…
实验内容分配

每4人一组 每组建立一个菌浓和OD600关系曲线。
分光光度计的实验


空白对照 吸光度和透光度 吸光度值的适用范围
离心管空重（g） 离心管+菌 重量（g） 编号 样品浓度（g/L） OD600
1.2

Dry cell weight (g/L)
0.9 0.6 0.3 0.0 0 1 2 3
大肠杆菌菌浓OD600与菌干重的关系曲线
OD600
实验材料

菌种： 大肠杆菌。（老师提前准备菌种和用于菌体干重测定 的菌液）
罐体、通气系统、搅拌系统、控温系统、传感 器等）
思考题
1.
2.
除了比浊法，还有其他什么常用方法可以测量 细菌数量，各有什么优缺点？ 通用发酵罐主要用于好氧微生物的大量培养， 发酵罐中那些部件与促进氧气的供给有关？
实验六 结束
请交报告！
【实验内容】


3. 菌液稀释
将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，吸取一定体积的菌液至试管 中，在不同试管中按不同比例进行稀释。（至少5个水平）


4. 测定吸光度
用未接种的肉膏蛋白胨液体培养基作空白对照，选用600nm 波长进行光电比浊测定。最好使其光密度值在 0.1~0.7 之内 (测定OD值前，将待测定的样品液振荡，使细胞均匀分布)。 做一个以去离子水稀释的对比试验（以去离子水做空白对 照），看肉膏蛋白胨培养基对OD600吸光度的影响。