绿色荧光蛋白——结构及应用

生物制药与研究

2017·08

124

Chenmical Intermediate

当代化工研究

绿色荧光蛋白——结构及应用

＊孙艺佩

（山东省实验中学 山东 250000）

摘要：绿色荧光蛋白（GFP）有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点，因此在各个领域已经有了广泛的应用，在细胞生物学

与分子生物学领域中，基因常被用作一个报导基因作为生物探针，拿来映证某些假设的实验方法；在医学领域，常用利用绿色荧光蛋白观

测肿瘤发生、生长和转移等过程。本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述。

关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；荧光生色机理；生色团；技术应用

中图分类号：Q 文献标识码：A

Green Fluorescent Protein——Structure and Application

Sun Yipei

(Experimental High School of Shandong Province, Shandong, 250000)

Abstract ：Green fluorescent protein ( GFP ) has the advantages of stability, high sensitivity, no toxicity, easy construction and so on. Therefore,

it has been widely used in various fields. In the field of cell biology and molecular biology, genes are often used as a reporter gene as a biological probe to show some hypothetical experimental methods. In the medical field, the green fluorescent protein is used to observe the process of occurrence, growth and metastasis of tumor. In this paper, the discovery and application background, structure, chromogenic mechanism, advantages compared to other fluorescent molecule and application in all fields of green fluorescent protein were reviewed.

Key words ：green fluorescent protein (GFP)；fluorescent chromogenic mechanism ；chromophore ；application of technology

引言

绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP 基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。

1.绿色荧光蛋白的结构及生色机理

从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。即便用酸、碱、盐酸胍使其蛋白变性，恢复中性或去除变性剂后GFP又可恢复发光性能。

GFP的发光现象由其生色团决定，GFP表达后折叠，在有氧条件下第66位氨基酸残基脱氢，使Ser65-Tyr66-Gly67环化形成对羟基苯咪唑啉酮，即生色团。

2.绿色荧光蛋白的优点

(1)性质极其稳定，高温、甲醛固定和石蜡包埋不影响其发光性能，对强光或长时间光照都有较强的耐受能力，对大多数普通酶有较强抗性。

(2)作为活体标记物,对目的基因结构功能没有影响，因此对细胞无毒害，且能在基因转化后遗传给后代。

(3)相较于其他更小的荧光分子，GFP不易扩散，用作标记时易被控制在一定的范围内，可避免由扩散造成的定位不准，使实验结果更加精确。

(4)GFP灵敏度高，不需要其他辅助底物，只需在蓝光或紫光的激发下即可产生较强的荧光，因此也更易识别，使用显微镜甚至肉眼就可以观察到。

(5)GFP荧光持续时间较长，在450-490nm蓝光激发下，能保持10min以上荧光。

3.绿色荧光蛋白的应用

(1)显像与示踪技术

由于GFP稳定无毒，所以可使动物体内复杂结构可视化，使得实验研究更加直观清晰。You等通过GFP标记的裸小鼠，检测GFP基因在小鼠各器官中的表达状况，为选择疾病模型和移植供体提供了依据。

肝细胞肝癌早期症状不明显，绝大多数肝癌发现时 已是中晚期，无法进行有效的手术治疗，Zhang等用稳定表达绿色荧光蛋白肝癌大鼠肿瘤筛选微转移时间窗，从而 准确定位微小转移灶，给予肝癌准确分期，使肝癌更早被 发现。

(2)报告基因

GFP灵敏度高，不需要其他辅助底物就能产生较强的荧光，且通过导入GFP基因在实验体内表达，对细胞无毒害，能在转化后遗传给后代，因此是理想的报告基因。作为报告基因，通过测定GFP的荧光强度可对生物体内一个或多个基因的表达水平进行检测，目前在动植物及微生物检测基因转化效率中已有较广泛的应用。

近年来，Liu等构建了绿色荧光蛋白标记SOX9基因慢病