绿色荧光蛋白——结构及应用

生物制药与研究
2017·08
124
Chenmical Intermediate
当代化工研究
绿色荧光蛋白——结构及应用
＊孙艺佩
（山东省实验中学 山东 250000）
摘要：绿色荧光蛋白（GFP）有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点，因此在各个领域已经有了广泛的应用，在细胞生物学
与分子生物学领域中，基因常被用作一个报导基因作为生物探针，拿来映证某些假设的实验方法；在医学领域，常用利用绿色荧光蛋白观
测肿瘤发生、生长和转移等过程。

本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述。

关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；荧光生色机理；生色团；技术应用
中图分类号：Q 文献标识码：A
Green Fluorescent Protein——Structure and Application
Sun Yipei
(Experimental High School of Shandong Province, Shandong, 250000)
Abstract ：Green fluorescent protein ( GFP ) has the advantages of stability, high sensitivity, no toxicity, easy construction and so on. Therefore,
it has been widely used in various fields. In the field of cell biology and molecular biology, genes are often used as a reporter gene as a biological probe to show some hypothetical experimental methods. In the medical field, the green fluorescent protein is used to observe the process of occurrence, growth and metastasis of tumor. In this paper, the discovery and application background, structure, chromogenic mechanism, advantages compared to other fluorescent molecule and application in all fields of green fluorescent protein were reviewed.
Key words ：green fluorescent protein (GFP)；fluorescent chromogenic mechanism ；chromophore ；application of technology
引言
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。

1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP 基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。

同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。

2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。

这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。

1.绿色荧光蛋白的结构及生色机理
从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。

它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。

11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。

β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。

即便用酸、碱、盐酸胍使其蛋白变性，恢复中性或去除变性剂后GFP又可恢复发光性能。

GFP的发光现象由其生色团决定，GFP表达后折叠，在有氧条件下第66位氨基酸残基脱氢，使Ser65-Tyr66-Gly67环化形成对羟基苯咪唑啉酮，即生色团。

2.绿色荧光蛋白的优点
(1)性质极其稳定，高温、甲醛固定和石蜡包埋不影响其发光性能，对强光或长时间光照都有较强的耐受能力，对大多数普通酶有较强抗性。

(2)作为活体标记物,对目的基因结构功能没有影响，因此对细胞无毒害，且能在基因转化后遗传给后代。

(3)相较于其他更小的荧光分子，GFP不易扩散，用作标记时易被控制在一定的范围内，可避免由扩散造成的定位不准，使实验结果更加精确。

(4)GFP灵敏度高，不需要其他辅助底物，只需在蓝光或紫光的激发下即可产生较强的荧光，因此也更易识别，使用显微镜甚至肉眼就可以观察到。

(5)GFP荧光持续时间较长，在450-490nm蓝光激发下，能保持10min以上荧光。

3.绿色荧光蛋白的应用
(1)显像与示踪技术
由于GFP稳定无毒，所以可使动物体内复杂结构可视化，使得实验研究更加直观清晰。

You等通过GFP标记的裸小鼠，检测GFP基因在小鼠各器官中的表达状况，为选择疾病模型和移植供体提供了依据。

肝细胞肝癌早期症状不明显，绝大多数肝癌发现时 已是中晚期，无法进行有效的手术治疗，Zhang等用稳定表达绿色荧光蛋白肝癌大鼠肿瘤筛选微转移时间窗，从而 准确定位微小转移灶，给予肝癌准确分期，使肝癌更早被 发现。

(2)报告基因
GFP灵敏度高，不需要其他辅助底物就能产生较强的荧光，且通过导入GFP基因在实验体内表达，对细胞无毒害，能在转化后遗传给后代，因此是理想的报告基因。

作为报告基因，通过测定GFP的荧光强度可对生物体内一个或多个基因的表达水平进行检测，目前在动植物及微生物检测基因转化效率中已有较广泛的应用。

近年来，Liu等构建了绿色荧光蛋白标记SOX9基因慢病
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2017·08125
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当代化工研究
毒载体，并在兔骨髓间充质干细胞中表达，实验中通过对荧光细胞数占比的计算测定传染效率，证实SOX9可在BMSCs稳定表达。

Duan等用GFP绿色荧光法筛选玉米转基因植株，并利用GFP鉴定其转化频率。

运用GFP基因作为报告基因，可有效避免实验结果检测时出现的假阳性现象，明显减少了后续工作量，从而使检测工作准确高效。

(3)荧光感受器
GFP由于具有光信号传导机制，可用作活细胞内的荧光感受器。

荧光感受器常用于检测各种分子对生物的有效性，甚至可以用于研究活细胞中蛋白质的构象变化。

在检测某物质对于某种生物是否有毒性方面，GFP荧光感受器也有较大的利用价值。

Hong等采用可表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌为模型，研究了新鲜的和经氯化钠溶液老化了的纳米银（AgNPs）的生物有效性，通过对分别处理的大肠杆菌GFP抑制率的统计和检测AgNPs在NaCl溶液中的吸收光谱，得出AgNPs抑制大肠杆菌GFP表达，影响重组质粒复制，抑制生长的结论。

(4)抗体生产
GFP现已广泛应用于各物种中作为标记蛋白进行细胞定位以及蛋白分析，因此，开发适用于多种属细胞的GFP抗体是必要的。

GFP抗体可通过免疫印迹方法对GFP及其标记蛋白进行定量，从而防止GFP扩散。

Dong等利用GFP基因cDNA全序列构建了原核表达载体，并进行亲和纯化免疫新西兰大白兔，结果表明该抗体能很好的识别莱茵衣藻、大肠杆菌等内的GFP。

这对继续开展GFP相关研究具有重要意义。

4.总结与展望
绿色荧光蛋白具有生色团稳定，可在活细胞内表达，对细胞无毒性等优点，它使得生物体内的复杂结构变得清晰可视，也使得某些物质在生物体内扩散路径得以呈现，如今，人们对绿色荧光蛋白在示踪、显像及报告基因方面的技术已日趋成熟，绿色荧光蛋白作为活体标记物辅助实验进行也成为实验者们常用的方法，但其还仍有许多需要改进的方面，如大多数荧光蛋白都存在寡聚现象，寡聚现象的出现造成实验结果不准、对检测物定位或研究移动路径的结果偏差较大，又如绿色荧光蛋白被激发后，荧光的时间也是有限的。

为解决这些问题，通过对绿色荧光蛋白进行恰当的修饰，使其荧光强度更强，时间更久，经研究表明，通过对有相互作用的侧链氨基酸进行突变，可消除寡聚趋势，因此，对绿色荧光蛋白进行变异与改造，将使其获得更广的应用领域，从而引导或辅助更多新成就的产生。

现在的科学家们仍在寻找新的荧光蛋白基因，进行着众多荧光技术的开发，在科 技不断进步发展的现如今，还有更多的问题等着我们去探索与解决。

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•【作者简介】
孙艺佩，女，山东省实验中学；研究方向：生物。