电生理实验常见问题解答

电生理实验常见问题解答（2）『转载』

whole－cell recording的液接电位的补偿问题

我们一般都是在电极入水后补偿液接电位。但在下电极的过程中有时基线还在波动，有时还很大。按理说当形成giga－cell后，就不能在调节pipe－offset了。但是，当形成巨阻封接后，电极内液和浴液之间的接触就隔断了，然后吸破形成whole cell。这个时候液接电位就消失了。但你入水时已经补了这个液接电位。也就是说形成whole cell后多补了液接电位大小的电压。你记录的电位是实际电位加上液接电位的值。很多人电极内液都是用的葡萄糖酸钾，用axon的液接电位计算公式算的葡萄糖酸钾版的电极内液和外液的液接电位都是10mv以上。这个时候误差就大了。这就产生个问题：这个液接电位怎么补？什么时候补？不补的话你钳制电压应该钳多少，电流钳下记录的膜电位与实际膜电位差多少？请大家说说各自的液接电位补偿的做法和理由。

这是一个不错的问题。

首先，让我们来看一看offset这个电压是怎么来的。他的来源很广泛，一部分是恒定值，比如放大器的输入offset；一部分是变化值，比如液接电位，它依赖于离子成分；一部分由附加环路产生，包括玻璃电极、试验浴槽或者是氯化银电极；还有一部分是膜片钳放大器产生的。我们调节offset，是把这个电压在放大器里加到command电压上了，从而使得在command电压为零的时候电流也为零。

液接电位在入水的时候有，一旦形成巨欧姆封接或者吸破后就不存在了，所以这一部分电位差值有必要考虑进去。

我一般的做法是入水之后补offset，一旦开始封接（>30M）就不再进行补偿，直至形成巨欧姆封接。在这个过程中，液接电位已经加到command电压里头去了，所以在吸破后测量其膜电位（电流钳）的时候，要将液接电位减去，比如测出来是-50mV，减去液接电位（以+10mV 为例），就变成了-60mV。在电压钳模式下的钳制电位也是一样要补上一个液接电位差值的，比如command电压是-60mV，实际输出是-70mV。不知我理解得对不对。

关于这个问题，axon的说明书里有比较详尽的补偿方法。

我用的灌流槽就中间一个小室，而且体积蛮大的。液体从小室下面进来，到达一定高度后从周围小孔出去。理论上来讲里边的液体应该可以得到充分交换，但不知为何小室内液体的ph要高于流入的和最后流出的acsf。而且液面比较高，控制不好的话脑片会浮起来。不过我设定的流速并不慢，我用的是蠕动泵灌流，流速在4ml/min左右。还有就是温度控制的不稳定，不知你用的那种全浸式灌流槽如何来控制这些问题。因为我觉得这两个问题直接影响了我能否记录到脑片的自发放电。我这两天做了几次，都能记录到自发放电，但持续时间不长，最长的也就2小时左右，短的只有半小时。不知你以前记录的时候一般能维持多少时间，怎样才能使脑片的活性维持较长的时间？

我自己没有做过成年鼠的脑片。不过我觉得是先分离海马再冰冻。但是如果没有冻过，脑组织很软，可能不太好分离。我想可能要先将脑组织冻1－2min在分离比较好些。这样一是组织有些硬度，比较好剥离海马；二是降低组织温度，减少神经元损伤。剥离时最好在冰板上进行，中间要加些4度ascsf保持组织湿润。

有人在做成年鼠脑片前是用冰冻的氧饱和的ACSF心脏灌流的。这样可以降低脑组织内部温度，你在剥离海马时神经元的损伤就小一些，从而提高海马神经元的存活率。

液面和你的记录槽齐平就可以了，太高会溢出可能漏到显微镜系统里；太低交换不好。脑片

可以用白金丝做的U型框粘上尼龙丝来压（陈军的那本书里有介绍怎么做），你也可以将尼龙网粘在白金框，或者银丝也可。你粘尼龙丝时候隔2－3mm粘一根，这个距离够你下电极了，不会说到做的时候还要调整尼龙网的位置。

至于为什么从孵育槽到记录槽要等1h才能记录到自发放电，我也不太清楚。不过我觉得应该要不了那么长时间。是不是你的记录槽液体交换慢了点，适当快点，混合气早点充——再试试看。

从你现在的情况看，切片估计不是问题了。不知孵育中可能的问题你注意没有：首先还是要给acsf预先给予混合气进行饱和；其次，在孵育时注意在尼龙网下不要形成气泡——可能造成脑片底部与液体接触不良；脑片在网上要平摊开，脑片之间最好不要覆盖和折叠。

我觉得由于你们这种记录槽液体是从底部流入，可能会造成脑片飘，记录不稳。6mm的高度有些高了，我们的记录槽大约3mm高，太高对显微镜成像效果会有影响。还有，你们的记录槽液体是自下向上流，那么脑片深处得到的氧饱和acsf就好一些，越往上交换过的acsf

就多一些。而且你们的槽子这么深，积累的废液也相对多些。或者这么说，同样的流速，6mm 深的记录槽液体和气体交换的时间要长于3mm的记录槽，这可能会影响到脑片在记录槽中的活性。而你要是加快流速的话，又会加剧脑片的飘荡，影响记录的稳定。所以，我觉得你的记录槽需要改进。要不降低高度试试，要不用我上次说的那个记录槽。不过用我说的记录槽，你的加温系统不知能不能上上去。

应该每个海马的锥体神经元都可以记录到0.1 mM glutamine 诱导的电流的，不知你是想记***AR介导的电流，还是AMPAR/KA介导的电流，如果是前者，应该用无Mg2+溶液和1~3 微摩尔的gly才可以记录到。另外，你配好的glutamine溶液要注意pH的变化，可能会偏酸，而H+对glutamine电流是抑制的。

model cell实际就是模拟patch记录的三个阶段: 1、电极入水。电路上就是一个10M的电阻；2、巨阻形成。电路上是1个10GM的电阻；3、whole cell形成。电路是一个500M的电阻和一个电容构成的回路。三种状况均可在seal test窗口中看到。seal test和你给step 刺激一样，都是在model cell上加个电压，窗口显示了记到的电流大小。同理你也可以在电压钳下给step，利用欧姆定律自己根据给的电压和记到的电流算电阻。这个值可能不会那么标准就等于三种状态下的电阻，这与仪器自身的噪声及性能有关，但不会有太大的偏差。如果偏差很大，比如应该为10M只记到5M，可能里面有问题。这时你就要排除是model cell 的问题还是放大器的问题。测model cel电阻排除一下model cell的问题。如果model cell 没问题，对照说明书用它校正一下放大器。

最大的可能就是封接系统漏气。将电极固定在holder上，电极尖端烧闭。三通管与带电极的holder整体浸入水中，从三通管给气体，看三通管、三通管与软管连接处、软管与holder 连接处等易于漏气的地方是否有气泡冒出。如有，用胶将其封闭，或者换新管。

还有一种可能就是电极堵了，不过电极堵的话电极电阻会有较大的增加，很好辨认。

电极内液是在入水之前灌充的，一旦钳制以后，可能就不能更换了，因为一旦更换，就不可避免引起振动，这是膜片钳实验的禁忌之一，很容易引起细胞的死亡。另外，关于渗透时间的问题，我曾经特意作过time-course，通常电极内液完全渗透到细胞内，使电极内和细胞内达到平衡大约在5min左右，有时候因为负压大小或其他的原因，可能大于或小于5min，虽然没有作过氨基酸，但是时间也是差不多的。