溶菌酶综述

溶菌酶的知识应用与临床诊断与研究前景

作者：林鹭地址：广西医科大学

一：摘要：本文主要介绍了溶菌酶的理化性质及分类，分离纯化方法，酶活力测定方法，还介绍了溶菌酶在食品﹑医药上的应用及其最新研究进展。

二：关键词：

溶菌酶分离纯化活力测定临床应用研究现状

三：前言：

溶菌酶又称脆壁质酶或N 一乙酰壁质聚糖水解酶，是英国细菌学家弗莱明于1922 年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，抗菌、抗病毒、抗肿瘤、无毒性的优点，使得溶菌酶在食品上和医药上都有广泛的应用，在生物技术中, 溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶, 可以说溶菌酶的发现是近代酶化学研究的最大成果之一[2]。这里通过对溶菌酶理化性质、分离纯化方法和应用的介绍，使大家对溶菌酶有更加清晰全面的了解，以便于对溶菌酶更深入地研究和探索。

四：溶菌酶概述

1.1 溶菌酶分布[3]

溶菌酶名称起源于1922 年，Alexander Fleming 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，就命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的外分泌液中。

1.2 溶菌酶分类[4]

国际酶学委员会根据其底物及作用特点又称其为酰胺酶或粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，编号E C3.2.1.17，与常见的蛋白酶、淀粉酶一样属水解酶系列。根据其来源不同一般可将溶菌酶分6 类：C型(chicken)、G型(goose)、无脊椎动物型(invertebrate-type)、噬菌体、细菌和植物来源溶菌酶。不同来源酶的分子量、氨基酸组成及酶特性各有不同，但三维结构显示来源于共同的进化起源。目前对C型溶菌酶研究较多，它是由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，含有4对二硫键，三维结构为较紧密的椭球形，它广泛存在脊椎动物如哺乳动物、鸟、爬行动物及鱼类和无脊椎动物如昆虫、甲壳类中。微生物来源的溶菌酶较多，广义上一般分以下几类：①内-N -乙酰己糖胺酶，与卵白溶菌酶一样，能分解构成细菌细胞壁骨架的聚糖；②酰胺酶，能切断连接聚糖和缩氨酸的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸键；③内肽酶和蛋白酶，能分解细胞壁缩氨聚糖的缩氨酸键；④β

-l,3、β-1,6-葡聚糖酶和甘露糖酶(葡甘露糖酶)，能分解酵母菌细胞壁；⑤磷酸甘露糖酶，与β-1,3、β-l ,6-葡聚糖酶、甘露糖酶(葡甘露糖酶) 共同作用，能分解原生质；⑥壳多糖酶，与葡聚糖酶共同作用，能分解霉菌或酵母菌；⑦脱乙酰壳多糖酶，主要分解霉菌中的毛霉菌(Mucor) 和根(Rhizopus )。

1.3 溶菌酶基本理化性质及作用机理

①溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白,化学性质非常稳定。当pH 值为1.2～11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变。在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强；当pH值为4～7100℃处理1 min仍能保持原酶活性;当pH值为3时能耐100℃加热处理45min;在干燥条件下,溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末,无臭,味甜。易溶于水,遭碱易破坏,不溶于丙酮和乙醚[5]。

2 溶菌酶分离纯化 [7]

2.1 材料与方法

2.1.1 原料与试剂

鲜鸡蛋(市售)、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等,以上药品均为分析纯。

2.1.2 主要仪器

分光光度计(7230G型)、搅拌器(200～300rpm)、离心(4000rpm)。

2.1.3 菌种

藤黄微球菌(Micrococcus luteus)

2.1.4 培养基

液体培养基:牛肉膏0.5g,葡萄糖0.1g, 氯化钠0.5g,蛋白胨1g, 溶于1L水中, 分装于三角瓶中,121℃灭菌15min。

固体培养基:牛肉膏5g, 葡萄糖1g, 蛋白胨10g,琼脂20g,置于1L水中,加热

溶解, 分装于三角瓶中,121℃灭菌15min。

2.2 工艺流程

溶菌酶分离纯化的工艺流程如下图所示：

2.3 操作步骤

2.3.1 蛋黄与蛋清的分离

取新鲜的鸡蛋,去壳,经分离器后,使蛋清与蛋黄分离。打破蛋壳时应避免蛋黄破散,使两者完全分离。

2.3.2 蛋清的预处理

将分离后的蛋清加入到搅拌器中,200～300rpm下搅拌10min, 再将蛋清搅拌稠度均匀即可,以不引起发泡为宜。最后用2～3层纱布过滤,以除去残余蛋壳和少量蛋黄。

2.3.3 吸附

将过滤后的蛋清冷至5℃后移入搪瓷捅中, 然后在搅拌下加入已处理好的树脂(14%加入),使其悬浮在蛋清中,在0～5℃下,搅拌吸附5h,然后在0～5℃静置20h以上,等分层后,弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗2～3次,以除去杂蛋白,最后晾干树脂,移入一个搪瓷缸中。

2.3.4 酶的洗脱

在上述树脂中加入同体积的0.15mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液,搅拌洗脱

20min,过滤洗脱液,除去一部分杂质。再重复洗脱2次。将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液,搅拌洗脱30min,滤出洗脱液,重复洗脱3次,滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。

2.3.5 沉淀

在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32%固体硫酸铵,搅拌使其溶解, 在4℃放置过夜。第2天,用虹吸法取出上清,4000rpm离心10min分离沉淀物。

2.3.6 透析

将沉淀物用蒸馏水全部溶解,然后放入透析袋中,在10℃水中透析过夜,以除去沉淀中的硫酸铵,收集透析液。

2.3.7 盐析

将透析液移入一容器内,用0.1mol/L的NaOH调溶液pH至8.5～9.0, 有白色沉

淀时,应立即离心除去沉淀。用2mol/LHCl调pH至3.5,搅拌, 并在0℃放置48h,同上离心收集沉淀物。

2.3.8 成品的干燥

将上述沉淀物加入到丙酮,搅拌,放置2h,收集沉淀,用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末,无臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。

3：酶活力测定方法[9]

3.1 底物的制备

将微球菌接种于液体培养基扩大培养(28℃,24h),再接种于固体培养基培养( 28℃,48h),用无菌水将菌体洗涤, 4000rpm 离心10min, 弃上清,再洗菌体数次, 最后用少量无菌水制成悬液, 冷冻干燥即得干菌粉。取干菌粉5g,加入少量

0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液置于匀浆器或研钵中研磨2min, 倾出并稀释至20～

在0.5～0.7范围为宜。

25mL,悬液的光密度OD

450

3.2 酶液的制备

准确称取干溶菌酶粉5mg,用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成0.05mol/L

酶液。

3.3 酶活力测定

将酶液与底物悬液分别置于25℃水浴中保温10～15min, 测底物悬液的OD

450