核酸的研究方法与原理

检测蛋白杂质 检测多糖杂质
Nanodrop 测定DNA浓度仅需１ul
质粒提取后琼脂糖电泳照片
基因组DNA的分子量>>RNA, 二者之间电泳迁移 率存在很大差别。
293细胞总RNA
解决办法：
28S
DNA酶（RNase free）消Fra bibliotek18S
化，再抽提纯化处理。
5S
具有相同分子量、不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中 的迁移速率不同: 双链闭环>双链开环>线型。
4、DNA与脂类分子的分离？
（一）、基因组DNA的提纯
DNA与蛋白结合，分离蛋白为主；基因组DNA 长链，注意防止断裂。
1、SDS/酶法
SDS打破细胞；苯酚除去蛋白；氯仿除去苯酚和脂 类；70%乙醇（0.3M NaOAc, pH 5）沉淀DNA
2、CTAB法
SDS CTAB
基因组DNA的提取纯化流程
• 探针：能与靶序列发生特异性杂交的，带有 一定标记可供识别的核酸片段
2、注意事项
1)、单细胞培养，注意细胞收获时间，微生物在对数 期；体外细胞系在健康生长期
2)、有细胞壁的及组织，需要酶处理、匀浆磨碎等方 法，处理过程尽可能快速、低温。
样品来源 动物组织
植物组织 酵母
细菌
各种组织细胞常用破碎方法
破碎细胞方法
DNA 提取
RNA 提取
坚韧的组织块绞碎后 组织块加液氮研磨匀
1)、紫外分光光度法。 RNA; 310Aμ26g0/=m5l0寡μ聚g/核ml苷ds酸DNA; 37 μg/ml ssDNA 40μg/ml
2)、荧光法 EB染色，与已知浓度的条带比较
2、质检
1)、A260 /A280= 1.8 (DNA); 2 (RNA)
A260 /A230 = 2.5 2)、琼脂糖电泳法
活性剂处理
或研磨方法破壁再用 反复冻融、表面活性
TRIzol 裂解
剂处理等
溶菌酶酶解或表面活 同上 性剂处理
碱裂解③，革兰氏阳 性菌需要先酶解破 坏细胞壁
二、核酸的提取与纯化
重点：
1、核酸与蛋白质的分离。通过变性蛋白质或蛋白水解 酶
2、核酸与多糖的分离。利用CTAB与核酸在低盐中沉淀
3、DNA与RNA的分离。不同情况不同处理。
1、琼脂糖电泳 （AGE）
配制简单，介质孔隙大，分离DNA （0.1-30 kb）
2、聚丙烯酰胺电泳 （PAGE）
介质孔隙小，精度高，分离小DNA （5-500bp）和 RNA，达到单碱基的精度
3、毛细管电泳 （CE）
高压直流，毛细管道，痕量分析，精度高，用于测 序
4、脉冲场凝胶电泳
脉冲电场，周期变化，分离超大DNA
（三）、质粒DNA的提纯
最经典的DNA提纯，最基础的分子生物学实验
1、碱裂解法
溶液I EDTA+RNase抑制剂 溶液II 0.2M NaOH+ 1%SDS 溶液III 3M KOAc+ 2 M HOAc 进一步用苯酚、氯仿除去蛋白，然后乙醇沉淀DNA
2、煮沸法
三、核酸的含量测定及质检
1、含量测定
• 分子大小 •分子构象 •凝胶浓度 •场强与电压 •嵌入染料的存在 •离子强度
第三节 核酸分子杂交技术
一、基本原理
• 只要一定长度的序列互补，即使来源不同的 单链DNA分子，可以形成双链
•DNA双链的形成和分离受温度和离子强度调 控
•远超底物DNA浓度的探针可以最大可能地标 记所有底物DNA
二、核酸探针的种类和标记
再匀浆①，柔软组织可 浆，再加 TRIzol②裂 用手动匀浆，培养细 解；培养细胞直接加
胞可利用低渗破膜、 TRIzol 反复冻融、超声、表
面活性剂等处理方法
液氮研磨
同上
质粒提取
溶 菌 酶 或 蜗 牛 酶 酶 TRIzol 直接裂解。细 酶解法或机械研磨
解，或玻璃珠、表面 胞壁厚的样品先用酶 破坏细胞壁，再进行
SDS/PK CTAB/EDTA
酚/氯仿 氯仿/异戊醇
Tris-EDTA buffer
（二）、细胞总RNA的提纯
RNase无处不在，RNA极易降解。所有的试剂必须去除 RNase。 1、对抗RNase free环境的创造
1)、DEPC（0.1%）去除水中的RNase，DEPC它能够与很 多酶的-NH，-SH或-OH等基团发生反应。121°C、20分钟 DPEC分解为二氧化碳和酒精除去。
操作步骤
2加热融化
3冷却65度制板
4插梳 5冷却成胶后拔梳子
1琼脂与缓冲液混合 6载样缓冲液混合
7点样，电泳
PAGE
分离范围：5 ~ 500 bp
CE HPCE
寡核苷酸的痕量分离及分析 交联PAGE、非交联PAGE、流动性多聚体
脉冲场凝胶电泳
分离大片段DNA 10kb ~ 100Mb
二、影响DNA电泳迁移率的因素
5. 其他性质
1)、荧光分子可插入碱基对中，发光 2)、DNA分子线性，高粘度 3)、RNA容易被碱降解，DNA则稳定；二价阳离 子是DNA酶和RNA酶的激活剂，保存需注意
RNA在碱性条件下水解
一、材料的选择与细胞破碎
1、材料来源：
细菌、酵母、体外培养细胞、组织、植物、其他 （根据实验目的而定）
DNA降解
RNA降解
28S 18S
5S
材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断;RNA提取环境温度过高 外源核酸酶污染
第二节 核酸的电泳技术
一、基本原理
• 在电场力的作用下，不同DNA分子在介质 中泳动速率不同，实现分离。
• 决定因素：电荷数（分子大小）、分子构象 （次级结构）
核酸的研究方法与原理
第一节 核酸的制备及质量鉴定
核酸的一些性质
1. 外 观
DNA：白色纤维状物质 RNA：白色粉末
2. 分子量 DNA、RNA均为大分子，分子量估算：DNA为核 苷酸对×600；RNA为核苷酸数×300
3. 溶解度
带大量的负电荷，其钠盐易溶于水 不溶于有机溶剂
4. 紫外吸收 DNA A260/A280=1.8 RNA A260/A280=2 1 A260 = 50 μg/ml DNA; 40μg/ml RNA
2)、试管、枪头等特殊处理（重金属放射源照射法、DEPC 水浸泡后烘干法）
3)、试剂专用 4)、添加RNase 抑制剂 5)、低温、快速
2、提纯RNA的商业化试剂——Trizol
苯酚
异硫氰酸胍
8-羟基喹啉 β-巯基乙醇 甲基橙
清除蛋白 溶解蛋白，分离核酸与蛋白 抑制RNase 保持还原态 pH指示，便于操作