高三尖杉酯碱对K562细胞的影响

高三尖杉酯碱对K562细胞的影响
目的探讨不同浓度及时间作用下高三尖杉酯碱对K562细胞的增殖和凋亡的影响。

方法使用MTT法在不同时间点检测不同浓度的高三尖杉酯碱对K562细胞增殖的影响。

使用流式细胞术在不同时间点检测不同浓度的高三尖杉酯碱对K562细胞凋亡的影响。

结果各组浓度的高三尖杉酯碱对K562细胞增殖均有抑制作用，其差异与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05），HHT 24 h的IC50浓度为0.48 ug/mL，48 h的IC50浓度为0.07 ug/mL，两组作用时间的IC50浓度有统计学差异（P＜0.05）。

各组浓度的高三尖杉酯碱均可诱导K562细胞凋亡，其差异与对应的对照组比较具有统计学意义（P＜0.05）。

结论①高三尖杉酯碱对K562细胞的增殖有抑制作用，呈时间及浓度依赖性；②高三尖杉酯碱亦可诱导K562细胞凋亡，但与浓度和作用时间不呈正相关性。

标签：高三尖杉酯碱；K562细胞；细胞增殖；细胞凋亡
高三尖杉酯碱（homoharringtonine，HHT）是一种从我国特有的植物海南粗榧（三尖杉属）中提取分离出的生物碱，它是一种细胞周期非特异性的抗肿瘤药。

我国学者已证明HHT对白血病有显著的疗效[1-2]。

为明确HHT在白血病细胞增殖及凋亡方面的作用，本实验以K562细胞为实验对象，探讨高三尖杉酯碱对K562细胞株的增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法
1.1主要试剂高三尖杉酯碱（杭州民生药业），胎牛血清（美国GIBICO公司），RPMI1640培养基（北京索莱宝生物公司），DMSO（美国Amresco公司），MTT（北京全式金公司），Annexin V/7-AAD细胞凋亡试剂盒（美国BD公司）。

1.2细胞培养K562细胞为慢性髓系白血病急变株，于液氮中冻存。

将K562细胞株复苏后，在培养瓶中加入含10%胎牛血清的1640培养液，置于二氧化碳培养箱内孵育（37℃，5%CO2），根据生长状态定期换液，将细胞培养至进入对数生长期。

1.3 MTT细胞增殖实验将对数生长期的K562细胞用培养液将细胞配成浓度为1×104/ml的细胞悬液并铺种于96孔板内，每孔铺种细胞悬液体积为100 μl；在各实验组加入不同浓度（50 ug/ml，5 ug/ml，0.5 ug/ml，0.05 ug/ml，0.005 ug/ml，0.0005 μg/ml）的高三尖杉酯碱，阴性组为细胞悬液，空白对照组加入相同体积的培养基，四周预留空白孔以PBS填充。

铺板后将96孔板置于细胞培养箱内孵育24 h或48 h。

根据各实验组吸光度依照如下公式计算细胞增殖抑制率，并分别计算24 h和48 h的IC50浓度。

细胞增殖抑制率=[1-（药物组-空白组）/（阴性对照组-空白组）]×100%。

1.4 Annexin V-PE/7-AAD双染法流式细胞术实验分组如上所述。

选取生长
对数期的细胞，配制成1×106/ml的细胞悬液，6孔板每孔加入2 ml的细胞悬液。

各药物实验组每孔加入对应浓度梯度的药物，对照组加入培养液，置于细胞培养箱内培养6 h，12 h及24 h。

Annexin V-PE/7-AAD双染法检测HHT作用K562细胞凋亡率。

1.5统计学分析采用统计软件SPSS19.0分析所有数据，计数资料以均数±标准差（x±s）表示。

组间比较采用独立样本t检验来分析。

2 结果
2.1高三尖杉酯碱对K562细胞增殖的影响MTT实验结果显示各组浓度的高三尖杉酯碱对K562均有抑制作用，呈浓度依赖性，不同浓度组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

HHT作用于K562细胞24 h的IC50为0.48 ug/mL作用48 h的IC50为0.07 ug/mL，两组作用时间的IC50浓度有统计学差异（P＜0.05）。

除50 ug/mL与5 ug/mL及（P>0.05）比较无统计学差异外，其余组间药物两两比较，均有统计学差异（P＜0.05）。

HHT为0.005 μg/ml时，对K562细胞即可产生明显的抑制作用，但当浓度达0.5 ug/mL及以上时，增殖抑制率无显著变化（P>0.05）。

2.2 Annexin V-PE/7-AAD双染法检测高三尖杉酯碱对K562细胞凋亡的影响
HHT可诱导K562细胞凋亡，且随药物浓度增加凋亡率增加并不显著，早期+晚期凋亡最高可达8.32%。

HHT作用K562细胞6 h后，各药物浓度组与阴性对照组（见图1）比较，凋亡率均有统计学差异（P＜0.05，见图2）。

HHT各浓度组间比较，凋亡均无统计学差异（P>0.05，见图3）。

3 讨论
近年来，关于HHT联合细胞毒性药物治疗恶性肿瘤，并且表现出增强细胞毒性作用甚至逆转肿瘤细胞耐药的报道逐渐增多，HHT也成为肿瘤治疗研究的热点。

本研究结果提示高三尖杉酯碱对K562细胞的增殖有抑制作用，呈时间和浓度依赖性，同时HHT可诱导K562细胞凋亡，但与浓度和作用时间不成正相关性。

HHT在血液肿瘤方面应用广泛，但有心脏毒性、骨髓抑制以及胃肠道反应等毒副作用。

骨髓抑制主要表现为可逆性的血小板和中性粒细胞计数减少。

其副作用的发生率与药物剂量有关，同等输注时间下，低剂量组患者不良反应发生率低于高剂量组。

本次实验提示HHT可通过抑制细胞增殖及促进细胞凋亡发挥抗白血病效应，而且HHT的IC50浓度与HHT对K562细胞作用时间呈负相关。

上述结果可为临床上使用HHT提供指导。

参考文献：
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[2]李会波，赛音其木格，白院生.高三尖杉酯碱在血液病治疗中的研究进展[J].内蒙古医学杂志，2011，43（1）：63-65.
[3]Nemunaitis J，Mita A，Stephenson J，et al.Pharmacokinetic study of omacetaxine mepesuccinate administered subcutaneously to patients with advanced solid and hematologic tumors[J].Cancer Chemother Pharmacol，2013，71（1）：35-41.
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