染色技术

1、单染色法 用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适 于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌 体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而 被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、 孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸 性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。 使用酸性染料时，必须降低染液的pH值，使其呈现 强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷， 才易于被酸性染料染色。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、 复染等四个步骤，具体操作方法是： １）涂片固定。 ２）草酸铵结晶紫染1分钟。 ３）自来水冲洗。 ４）加碘液覆盖涂面染1分钟。 ５）水洗，用吸水纸吸去水分。 ６）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色， 30秒后水洗，吸去水分。 ７）蕃红染色液（稀）染10秒钟后，自来水 冲洗。干燥，镜检。 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色， 负反应菌体都呈红色。
4、单纯染料
这类染料的化学亲和力低，不能和被染的 物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物 而定，因为它们大多数都属于偶氮化合物，不 溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类 （Sudanb）的染料。
三、制片和染色的基本程序
微生物的染色方法很多，各种方法应用的 染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片 及一套染色操作程序。
单染色一般要经过涂片、固定、染色、水 洗和干燥五个步骤。
染色结果依染料不同而不同：
石碳酸复红染色液：着色快，时间短，菌 体呈红色。 美兰染色液：着色慢，时间长，效果清晰， 菌体呈兰色。 草酸铵结晶紫染色液：染色迅速，着色深， 菌体呈紫色。
2、革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种 鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
2、碱性染料
这类染料电离后染料离子带正电，可与酸 性物质结合成盐。微生物实验室一般常用的碱 性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、 中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下， 细菌易被碱性染料染色。
3、中性（复合）染料 酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性 （复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基 姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核 的染色。
第二章 染色技术
由于微生物细胞含有大量水分（一般在8090%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差 别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以， 除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌 数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能 在显微镜下进行观察。
染色后的微生物标本是死的，在染色过程中 微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完 全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须 注意。
1、制片 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接 种环进行无菌操作，挑取培养物少许，臵载玻 片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约 1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团， 不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一 滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中 进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物 或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布 于载玻片上即可。
人工染料:也称煤焦油染料，多从煤焦油中 提取获得，是苯的衍生物。多数染料为带色的 有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂 中。为使它们易溶于水，通常制成盐类。
染料可按其电离后染料离子所带电荷的性 质，分为四大类: • 酸性染料 • 碱性染料 • 中性（复合）染料
• 单纯染料
1、酸性染料
这类染料电离后染料离子带负电，如伊红、 刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等， 可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解 产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加， 这时选择酸性染料，易被染色。
5、脱色
用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。 可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种 类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸 溶液。
6、复染
脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被 脱色部位形成鲜明的对照，便于观察。革兰 氏染色在酒精脱色后用番红、石碳酸复红最 后进行染色，就是复染。
7、水洗 染色到一定的时候，用细小的水流从标本 的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染 料则保留。
2、自然干燥
涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为 了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载 玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微 加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时 间过长，以防标本烤枯而变形。
3、固定 标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：
１）杀死微生物，固定细胞结构。
２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止 标本被水冲洗掉。 ３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生 质比活的原生质易于染色。
一、染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和 化学因素的作用而进行的。
物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗 透、吸附作用等。
化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发 生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附， 且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸 附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力， 易于吸附。
8、干燥 着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸 水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干， 用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌 体擦掉。
9、镜检 干燥后的标本可用显微镜观察。
综上所述，染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脱色→复染 →水洗→干燥→镜检。
四、染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染 色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但 不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以 上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴 别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和 抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构 的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。 食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏 染色法。
固定常常利用高温，手执载玻片的一端 （涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯 火焰外层尽快的来回通过3—4次，共约2—3 秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤， 不觉过烫为宜（不超过60℃），放臵待冷后， 进行染色。
以上这种固定法在微生物实验室中虽然应 用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细 胞结构时不适用，应采用化学固定法。化学固 定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精 和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的锇酸等。 锇酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常 用。
wenku.baidu.com
应用锇酸固定细胞的技术如下：在培养皿 中放一玻璃，在玻璃上放臵玻璃毛细管，在毛 细管中注入少量的1—2%锇酸溶液，同时在玻 璃上再放臵湿标本涂片的载玻片，然后把培养 皿盖上，经过1—2分钟后把标本从培养皿中取 出，并使之干燥。
4、染色 标本固定后，滴加染色液。染色的时间各 不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色 时还要加热。染料作用标本的时间平均约1—3 分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有 标本的部分）应该浸在染料之中。 若作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与 染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的 亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定 或染色同时进行。
影响染色的其它因素:
• 菌体细胞的构造
• 外膜的通透性
• 此外，培养基的组成、菌龄、染色液中的电 解质含量和pH、温度、药物的作用等，也都 能影响细菌的染色。
二、染料的种类和选择
染料分为天然染料和人工染料两种。
天然染料有:胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏 木素等，它们多从植物体中提取得到，其成分 复杂，有些至今还未搞清楚。
1、用碱性染料结晶紫对菌 液涂片进行初染 2、用碘溶液进行媒染，其 作用是提高染料和细胞间 的相互作用从而使二者结 合得更牢固。 3、用乙醇或丙酮冲洗进行 脱色。在经历脱色后仍将结 晶紫保留在细胞内的为革兰 氏阳性细菌，而革兰氏阴性 细菌的结晶紫被洗掉，细胞 呈无色。 4、用一种与结晶紫具有不 同颜色的碱性染料对涂片进 行复染。例如沙黄，它使原 来无色的革兰氏阴性细菌最 后呈现桃红到红色，而革兰 氏阳性细菌继续保持深紫色
但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须 把它们的物理形式加以改变（如改变pH值）， 才利于吸附作用的发生。相反，碱性物质（如 细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变 为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生 吸附作用。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之 间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体 蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时 染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和 带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌 学上常用碱性染料进行染色。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染 后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不 被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大 类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰 氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一 种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带 紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝 大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革 兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无 芽胞杆菌都呈现负反应。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成 和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。 现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核 蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫 的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物 结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色 反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低， 在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染 料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以 染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条 件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都 可呈正反应；pH很低时，则可都呈负反应。此 外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的 通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱 色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间， 脱色方法也应严格控制。