金银花中绿原酸提取法

金银花中绿原酸提取法(索氏提取法为最佳提取方法)
1 . 1 主要材料与仪器
金银花( 购自药房) , 无水乙醇( AR ), 甲醇( A R 厂) , 乙酸乙酯( AR )。

索氏提取器(上海洪纪仪器设备有限公司),ESJ2 05 4型电子天平( 沈阳龙腾电子有限公司),UV 22 50 型紫外分光度计( 日本岛津) , 水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂) , KD M 型可调控温度电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司), 800 1 离心机(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司), K Q 50 B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 。

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2 标准曲线的绘制
准确称取绿原酸对照品1 0 m g , 用60 %乙醇溶解并定容至50 m L ,备用.然后分别取0 . 0 、0 . 5 、1 . 0 、2 . 0 、3 . 0 、4 . 0 、5 . 0 mL , 再用60 %乙醇定容至50 mL以4号标准样在200 ~ 600 n m 波长范围内进行波长扫描, 测出绿原酸的最大吸收波长为326 n m。

然后以60 % 乙醇作空白对照,测定每个标准样的吸光度( A ) 值。

再以吸光度( A )值为纵坐标, 以标准样品质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

得到回归方程y = 9 . 8019 x+ 0 . 0186R2= 0 . 999 3 。

1 ) 索氏提取法
干燥的金银花用研钵研碎, 称取10 g , 用滤纸包好, 置于索氏提取器中, 取有机溶剂80 mL , 先往索氏提取器中加70 % 的甲醇至与虹吸管相平, 剩余液体加入圆底烧瓶中, 对样品浸泡2 h , 然后在水浴锅上加热回流, 控制温度在70 左右, 虹吸5 次。

把回流液倒于蒸馏瓶中进行减压蒸馏至30 mL , 超声溶解, 用0 . 25 u m 滤膜过滤, 测定其吸光度。

2 ) 超声波法
干燥的金银花用研钵研碎, 称取6 g , 置于锥形瓶中, 加入准确量取的100 mL 蒸馏水, 超声溶解,一段时间后过滤, 向滤渣中再加100 mL 蒸馏水,重复上述步骤, 把所得的滤液在离心机以3 000 r /m i n离心10 m i n .在把溶液进行减压蒸馏至30 mL ,得待测液, 测定其吸光度。

3 ) 水提法
干燥的金银花用研钵研碎, 称取6 g , 置于锥形瓶中, 加入准确量取的1 00 mL 蒸馏水, 水
浴加热,控制好温度, 一段时间后过滤, 向滤渣中再加100mL 蒸馏水, 重复上述步骤, 把所
得的滤液在离心机以3000 r /m i n 离心10 m i n 。

在把溶液进行减压蒸馏至30 mL 得待测液, 测定其吸光度。

2 . 1 . 1 不同溶剂对提取绿原酸的影响
本次实验对索氏提取法的不同溶剂对绿原酸的影响进行了研究, 具体方法和结果见表2。

由表2看出, 不同溶剂提取率不同, 70 % 甲醇时最大。

甲醇的溶解性能比较好, 对中草药细胞的穿透能力较强。

亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖外, 大多能在乙醇中溶解。

难溶于水的亲脂性成分, 在甲醇中的溶解度也较大, 沸点较低, 但有毒性, 所以用是要注意安全。

金银花叶片中绿原酸提取法(提取效率酶法优于超声波法,超声波法优于醇法)
金银花叶片材料取回后去杂，并在4 5℃左右干燥，粉碎，颗粒直径控制在0．1 m m 以上。

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2 方法
1．2．1 提取方法的单因素试验及工艺参数的优化分别采用醇法、超声波法、酶法3种方法提取，3种提取方法的工艺流程、单因素选择及工艺参数的优化如下：
醇法：样品一乙醇提取液一过滤一滤液6 0℃干燥一初提物一0.2 m o l／L盐酸溶解，定容1 0 0 m L一取样0 .1 m L ，0．2 m o l／L盐酸溶解定容5 0 m L一含量测定。

以提取时间、温度、p H 、乙醇浓度、提取次数作单因素试验，然后以单因素试验结果设计四因素三水平的正交试验，优化醇法提取工艺。

超声波法：样品一按一定料液比加溶剂浸润一超声处理一过滤一滤液6 0℃干燥一初提物一0 .2m o l／L盐酸溶解，定容1 0 0 m L一取样0.1 m L，0．2 m o l／L盐酸溶解定容5 0 m L 一含量测定。

以提取时间、温度、超声功率、料液比、乙醇浓度、提取次数作单因素试验，然后以单因素试验结果设计四因素三水平的正交试验，优化超声波法提取工艺。

酶法：样品一按一定料液比加超纯水配置的复合酶液一一定条件下静置酶解一过滤一滤液6 0℃干燥一初提物一0.2 m o l／L盐酸溶解，定容1 0 0 m L一取样0．1 m L，0.2 m o l／L盐酸溶解定容5 0 m L一含量测定。

首先分别以3 0 g／L 纤维素酶、2 0 g／L蜗牛酶+1 0 g/ L 果胶酶、2 0 g／L纤维素酶+ 1 0 g／L果胶酶、2 0 g／L纤维素酶+ 1 0 g／L半纤维素酶在3 6℃作预提取试验，筛选最佳的酶制剂。

然后以最佳酶制剂的温度、反应时间、p H值、酶用量作单因素试验，根据单因素试验结果设计四因素三水平的正交试验，优化酶法提取工艺。

1．2．2 绿原酸含量的测定采用7 5 6 C R T型紫外分光光度计于波长3 2 4 n m测定，求得回归方程为y= 4 .1 1 8 8×1 0 + 1 6．0 6 8 6 ( y为绿原酸质量浓度( p ~ g／m L )，X为吸光度)。

由于紫外分光光度法所测定的绿原酸含量是一个具有相关基团的总量，即绿原酸和异绿原酸的总量，因此绿原酸的含量是绿原酸与异绿原酸的总量，即：
绿原酸提取量( g／m L ) = 绿原酸质量浓度( p ~ g／m L )×1 0×稀释倍数；
绿原酸含量( g ) = 绿原酸提取量×1 0 0 金银花叶片样品的量( 1 0 0 g样品质含量)。

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3 绿原酸活性试验
( 1 )常规制备: L B培养基。

( 2 ) 菌液制备：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别接种于营养琼脂斜面培养基，3 7℃厌氧培养1 8 h，生长后的菌落用无菌接种环挑选少量，置于无菌生理盐水中，调整至1 0 个菌落／m L菌液，再稀释1：1 0 0备用。

( 3 ) 含菌平板的制备：在无菌条件下将已灭菌的培养基倾入平皿中冷却至室温，将1 m L菌液平铺于平板中涂抹均匀。

( 4 ) 加入提取物：每只平板内放入4只牛津杯，牛津杯内准确加入一定剂量的药物及0．2 m L生理盐水。

( 5 ) 培养：将平皿置于3 7℃培养箱中培养，观察菌落生长情况。