第五讲：二维核磁共振谱介绍
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观测不灵敏核的化学位移 异核实验目前遇到最多的是13C-1H耦合系统，
此外15N-1H，29Si-1H系统也得到了广泛的应 用
Байду номын сангаас
常用的3种二维异核实验
HMQC HMBC HSQC
HMQC（异核多量子相关谱）实验
HMQC实验是通过检测1H信号而达到间接检测13C或15N信号 的一种方法
是成功率最高的异核相关实验，正逐步取代一维的不灵敏核 检测
但是用于自旋锁定的组合脉冲是不相同的， 锁定功率和锁定时间也有较大的区别 ROESY也不可避免地受到J耦合的干扰，而 且难以用一般的方法予以消除
异核二维NMR谱简介
异核二维NMR谱主要指的是检测1H而同时间 接观测13C、15N等核的逆检测二维相关谱
记录不灵敏核FID的HECSY实验已被淘汰 直接观测灵敏核的FID，通过核间耦合间接地
检测期（t2） 在检测期t2期间采集的FID信号是F2域的时间函数，所对应的轴通 常是一维核磁共振谱中的频率轴，即表示化学位移的轴。但检测期t2期间采集的 FID信号都是演化期t1的函数，核进动的磁化矢量具有不同的化学位移和自旋偶 合常数，其FID信号是这些因素的相位调制的结果。因此，通过控制时间长度可 使某期间仅表现化学位移的相位调制，而某期间又仅表现自旋耦合的相位调制， 通过施加不同的调制就产生了各种不同的二维核磁共振谱。
演化期（t1） 在预备期末，施加一个或多个90脉冲，使系统建立共振非平衡状 态。演化时间t1是以某固定增量t1为单位，逐步延迟t1。每增加一个t1，其对应 的核磁信号的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延迟增量t1可得到二维实验中的 另一维信号，即F1域的时间函数。
混合期（m） 由一组固定长度的脉冲和延迟组成。在混合期自旋核间通过相干 转移，使t1期间存在的信息直接影响检测期信号的相位和幅值。根据二维实验所 提供的信息不同，也可以不设混合期。
二维实验的脉冲序列
二维实验中的参数设置—参数表
实验参数的设定
F2维中的参数设定参照一维方法进行，采样点数少于一维的，因此二维 实验的数字分辨率比一维实验低得多
F1维的采样数要少于F2维，这是基于实验时间的考虑 二维实验时间 =（等待时间+脉冲序列作用时间+F2维采样时间）x F1维
采样点数 x 累加次数 F2维采样时间 = F2维采样点数 /（2 x 谱宽），但等待时间远远大于F2
2D Gradient COSY-45
2D Gradient DQF-COSY
2D Gradient TOCSY, 混合时间10ms
2D g-NOESY spectrum of paeoniflorin with CryoProbe in Pyridine-d5
未知物结构解析例一(HSQC)
未知物结构解析例一(HMBC)
未知物结构解析例一(D交换氢谱)
未知物结构解析例二（1H NMR）
未知物结构解析例二（13C NMR）
未知物结构解析例二(DEPT-90)
未知物结构解析例二(DEPT-135)
未知物结构解析例二(COSY)
未知物结构解析例二(HSQC)
显示方式分为绝对值显示和相敏显示两种，绝对值显示的峰 有好的信噪比，相敏显示有高的分辨率
二维谱中的基线调整十分重要
二维核磁共振谱的基本理论
同核二维谱实验 异核二维谱实验 例题与练习
常用的5种二维同核实验
COSY DQF-COSY TOCSY NOESY ROESY
COSY实验
NOESY实验是探测核间空间距离的实验，依 据的是核之间与距离6次方呈反比的 Overhauser作用
脉冲序列为三个90o脉冲：90o-t1- 90o –tm90o –t2
混合时间tm应该根据核的弛豫时间而定 J干扰峰的消除
ROESY（旋转坐标系中的 NOESY）实验
脉冲序列： 90o-t1- 自旋锁定-t2 脉冲序列与TOCSY中所示的序列完全相同，
第五讲：二维核磁共振谱介绍 Introduction of 2D NMR Spectroscopy
庞文民
2D－NMR
1971年Jeener 首先提出 2D－NMR 思想: 具有两个时间变量的nmr
1976年 Ernst小组成功实现了2D－NMR实验后，确 定了二维核磁共振的理论基础
20世纪80年代：2D－NMR加速发展 用途： 解析复杂有机分子最有力的工具；溶液中分
与HMQC实验相比，HMBC实验的信噪比要低很多，沿F1走 向的t1噪声峰特别强（可通过数学的方法消除）
HMBC谱中一个氢峰可以和多个碳峰相关，主要用于解决四 级碳信号的问题
HMBC的脉冲序列
HSQC（异核单量子相关谱）实验
在外形上与HMQC完全相同 各项参数要求颇高，当参数不是很完美时，
子的三维空间结构的测定；分子动态过程的研究： 多维NMR技术：研究生物大分子（蛋白质、核酸等）
最有效的方法
二维核磁共振谱的特点
将化学位移、偶合常数等核磁共振参数展开 在二维平面上，这样在一维谱中重叠在一个 频率坐标轴上的信号分别在两个独立的频率 坐标轴上展开，减少了谱线的拥挤和重叠， 提供了自旋核之间相互作用的新信息,获得 更多的信息
二维谱的表示方式
堆积图 等高线图
堆积图和等高线图
F2
（a）堆积图
F1 F1
F2
（b）等高线图
等高线图的习惯表示
横坐标—F2维—对应真实采样的t2维 纵坐标—F1维—对应间接采样的t1维
二维实验的脉冲序列
二维实验的脉冲序列
预备期（D1） 使自旋体系恢复Boltzmann分布，而处于初始热平衡状态。理论 上应取D1≥5T1（T1为纵向弛豫时间），但为节省时间，实验中一般取D1 =(2～ 3)T1。
消除或降低其强度的方法：相位循环（例如，COSY实验的 完整相位循环至少包括4次实验，因此累加次数就是4的倍数）
DQF-COSY实验
脉冲序列采用三个90o脉冲： 90o-t1- 90o –Δ90o –t2
目的是为了降低对角峰的强度，从而使位于 对角峰附近的交叉峰较易辨认
TOCSY（全相关谱）实验
很容易形成相位难调的情况 在F1维的分辨率要比HMQC高，在三维NMR
中得到比HMQC实验广得多的应用
HSQC的脉冲序列
未知物结构解析例一（1H NMR）
未知物结构解析例一（13C NMR）
未知物结构解析例一(DEPT-90)
未知物结构解析例一(DEPT-135)
未知物结构解析例一(COSY)
杂峰与杂峰的消除
轴峰：沿F1维出现在参考频率为零处，与演化期间因纵向弛 豫而产生的纵向磁化强度有关。因为演化期的纵向弛豫不可 避免，因此轴峰必然存在
t1噪声峰：沿F1维出现的杂峰，可由许多复杂因素引起，例 如宏观退磁场效应和饱和效应等
镜像峰：关于中心频率对称的峰，二维镜像峰是复数Fourier 变换所固有的
利用窗函数进行变迹处理：相移的正弦钟函数、高斯函数或 平方正弦钟函数
利用正弦钟函数对截尾严重的FID进行修饰，可以消除由于 截尾时的高频截断造成的震荡尾波
F1维的间接采样方式有实数型和复数型两种，F1维的 Fourier变换方式应与采样方式相适应
二维Fourier变换应先变换t2维然后再变换t1维，顺序不可颠 倒
HMBC（异核多重键相关谱）实验
HMQC的严重缺陷：无法判定季碳的化学位移，需要通过长 程耦合来辨认归属
HMBC实验的脉冲序列是以HMQC实验为基础，本质上说是 借助较小耦合常数完成的HMQC实验
由于长程耦合常数之间的差值与耦合常数本身之比很大，旋 进过程中带来的误差就很大，给调整相位带来了很大的困难， 因此一般显示为绝对值谱
两个时间变量t1 t2_－－函数S（t1 ,t2） 两次Fourier变换－－以两个频率为函数的2D-nmr谱 二维NMR实验：通过特殊的脉冲序列来获得自旋核之间各种 信息的。 二维NMR实验的脉冲序列：一般由四个区域组成：预备期 D1（preparation）,演化期t1(evolution),混合期tm和检测期t2 二维NMR实验的关键：是引入了第二个时间变量－演化期t1 二维谱学原理：省略
COSY实验是最简单的二维实验，用途最为广泛， 脉冲序列由两个90o脉冲组成
脉冲序列：90o-t1- 90o-t2 两个时域长度由各维的采样点数和谱宽决定 采样点间隔在谱宽确定以后依照Nyquist采样定律确
定 t1维中，采样间隔表示为Δt1，又称t1增量，也受
Nyquist采样定律制约，由F1维的谱宽决定
未知物结构解析例二(HMBC)
未知物结构解析例二(D交换氢谱)
未知物结构解析答案
未知物一
未知物二
1H-13C HMQC实验检测的就是1H谱中的13C的卫星峰 当样品为天然丰度时，与12C或14N相连的1H主峰需要在实验
中用合适的方法滤去 在4脉冲HMQC实验中，滤去1H主峰是通过相位循环完成的，
一般效率很高 当样品浓度极低时，需要借助BIRD序列增强滤波功能
HMQC脉冲序列
双线性旋转去耦（bilinear rotation decoupling, BIRD）
TOCSY可以将每一个耦合网络用一个方格网 连接起来
脉冲序列为一个90o脉冲加上一串自旋锁定功 能的组合脉冲： 90o-t1- 自旋锁定-t2
旋转坐标系实验（有自旋锁定过程，如 TOCSY和ROESY）和实验室坐标系实验 （无自旋锁定过程，如COSY、DQF-COSY 和NOESY）
NOESY实验
相干转移谱和极化转移谱
基于耦合的相干转移谱：核自旋间的J耦合 （通过原子核间化学键电子的间接作用而发 生的耦合，又称间接耦合），与横向磁化强 度相联系
基于动力学过程的极化转移谱：D耦合（不 需要经过介质的空间相互作用，又称直接耦 合或偶极偶极耦合），与纵向磁化强度相联 系
二维核磁共振实验
一维谱：一个脉冲频率（一个频率）的函数，一个变量， 二维谱：两个独立的变量，nmr信号受这两个变量的影响
维采样时间 二维谱上的精细结构的辨认主要靠F2维的分辨 F1维由于不进行真实采样，没有接收机增益的参数 F2维采用正交的检测方式，F1维有正交复数检测和单通道实数检测两种
方式，应与Fourier变换方式相对应
处理参数的设定
由于F1维采样点的增加从测谱时间上考虑有困难，因此采用 零充填的方法使变换点大于采样点，提高数字分辨率，但是 不能提高谱峰的分辨率，通常信号会出现谱峰拖长的现象
此外15N-1H，29Si-1H系统也得到了广泛的应 用
Байду номын сангаас
常用的3种二维异核实验
HMQC HMBC HSQC
HMQC（异核多量子相关谱）实验
HMQC实验是通过检测1H信号而达到间接检测13C或15N信号 的一种方法
是成功率最高的异核相关实验，正逐步取代一维的不灵敏核 检测
但是用于自旋锁定的组合脉冲是不相同的， 锁定功率和锁定时间也有较大的区别 ROESY也不可避免地受到J耦合的干扰，而 且难以用一般的方法予以消除
异核二维NMR谱简介
异核二维NMR谱主要指的是检测1H而同时间 接观测13C、15N等核的逆检测二维相关谱
记录不灵敏核FID的HECSY实验已被淘汰 直接观测灵敏核的FID，通过核间耦合间接地
检测期（t2） 在检测期t2期间采集的FID信号是F2域的时间函数，所对应的轴通 常是一维核磁共振谱中的频率轴，即表示化学位移的轴。但检测期t2期间采集的 FID信号都是演化期t1的函数，核进动的磁化矢量具有不同的化学位移和自旋偶 合常数，其FID信号是这些因素的相位调制的结果。因此，通过控制时间长度可 使某期间仅表现化学位移的相位调制，而某期间又仅表现自旋耦合的相位调制， 通过施加不同的调制就产生了各种不同的二维核磁共振谱。
演化期（t1） 在预备期末，施加一个或多个90脉冲，使系统建立共振非平衡状 态。演化时间t1是以某固定增量t1为单位，逐步延迟t1。每增加一个t1，其对应 的核磁信号的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延迟增量t1可得到二维实验中的 另一维信号，即F1域的时间函数。
混合期（m） 由一组固定长度的脉冲和延迟组成。在混合期自旋核间通过相干 转移，使t1期间存在的信息直接影响检测期信号的相位和幅值。根据二维实验所 提供的信息不同，也可以不设混合期。
二维实验的脉冲序列
二维实验中的参数设置—参数表
实验参数的设定
F2维中的参数设定参照一维方法进行，采样点数少于一维的，因此二维 实验的数字分辨率比一维实验低得多
F1维的采样数要少于F2维，这是基于实验时间的考虑 二维实验时间 =（等待时间+脉冲序列作用时间+F2维采样时间）x F1维
采样点数 x 累加次数 F2维采样时间 = F2维采样点数 /（2 x 谱宽），但等待时间远远大于F2
2D Gradient COSY-45
2D Gradient DQF-COSY
2D Gradient TOCSY, 混合时间10ms
2D g-NOESY spectrum of paeoniflorin with CryoProbe in Pyridine-d5
未知物结构解析例一(HSQC)
未知物结构解析例一(HMBC)
未知物结构解析例一(D交换氢谱)
未知物结构解析例二（1H NMR）
未知物结构解析例二（13C NMR）
未知物结构解析例二(DEPT-90)
未知物结构解析例二(DEPT-135)
未知物结构解析例二(COSY)
未知物结构解析例二(HSQC)
显示方式分为绝对值显示和相敏显示两种，绝对值显示的峰 有好的信噪比，相敏显示有高的分辨率
二维谱中的基线调整十分重要
二维核磁共振谱的基本理论
同核二维谱实验 异核二维谱实验 例题与练习
常用的5种二维同核实验
COSY DQF-COSY TOCSY NOESY ROESY
COSY实验
NOESY实验是探测核间空间距离的实验，依 据的是核之间与距离6次方呈反比的 Overhauser作用
脉冲序列为三个90o脉冲：90o-t1- 90o –tm90o –t2
混合时间tm应该根据核的弛豫时间而定 J干扰峰的消除
ROESY（旋转坐标系中的 NOESY）实验
脉冲序列： 90o-t1- 自旋锁定-t2 脉冲序列与TOCSY中所示的序列完全相同，
第五讲：二维核磁共振谱介绍 Introduction of 2D NMR Spectroscopy
庞文民
2D－NMR
1971年Jeener 首先提出 2D－NMR 思想: 具有两个时间变量的nmr
1976年 Ernst小组成功实现了2D－NMR实验后，确 定了二维核磁共振的理论基础
20世纪80年代：2D－NMR加速发展 用途： 解析复杂有机分子最有力的工具；溶液中分
与HMQC实验相比，HMBC实验的信噪比要低很多，沿F1走 向的t1噪声峰特别强（可通过数学的方法消除）
HMBC谱中一个氢峰可以和多个碳峰相关，主要用于解决四 级碳信号的问题
HMBC的脉冲序列
HSQC（异核单量子相关谱）实验
在外形上与HMQC完全相同 各项参数要求颇高，当参数不是很完美时，
子的三维空间结构的测定；分子动态过程的研究： 多维NMR技术：研究生物大分子（蛋白质、核酸等）
最有效的方法
二维核磁共振谱的特点
将化学位移、偶合常数等核磁共振参数展开 在二维平面上，这样在一维谱中重叠在一个 频率坐标轴上的信号分别在两个独立的频率 坐标轴上展开，减少了谱线的拥挤和重叠， 提供了自旋核之间相互作用的新信息,获得 更多的信息
二维谱的表示方式
堆积图 等高线图
堆积图和等高线图
F2
（a）堆积图
F1 F1
F2
（b）等高线图
等高线图的习惯表示
横坐标—F2维—对应真实采样的t2维 纵坐标—F1维—对应间接采样的t1维
二维实验的脉冲序列
二维实验的脉冲序列
预备期（D1） 使自旋体系恢复Boltzmann分布，而处于初始热平衡状态。理论 上应取D1≥5T1（T1为纵向弛豫时间），但为节省时间，实验中一般取D1 =(2～ 3)T1。
消除或降低其强度的方法：相位循环（例如，COSY实验的 完整相位循环至少包括4次实验，因此累加次数就是4的倍数）
DQF-COSY实验
脉冲序列采用三个90o脉冲： 90o-t1- 90o –Δ90o –t2
目的是为了降低对角峰的强度，从而使位于 对角峰附近的交叉峰较易辨认
TOCSY（全相关谱）实验
很容易形成相位难调的情况 在F1维的分辨率要比HMQC高，在三维NMR
中得到比HMQC实验广得多的应用
HSQC的脉冲序列
未知物结构解析例一（1H NMR）
未知物结构解析例一（13C NMR）
未知物结构解析例一(DEPT-90)
未知物结构解析例一(DEPT-135)
未知物结构解析例一(COSY)
杂峰与杂峰的消除
轴峰：沿F1维出现在参考频率为零处，与演化期间因纵向弛 豫而产生的纵向磁化强度有关。因为演化期的纵向弛豫不可 避免，因此轴峰必然存在
t1噪声峰：沿F1维出现的杂峰，可由许多复杂因素引起，例 如宏观退磁场效应和饱和效应等
镜像峰：关于中心频率对称的峰，二维镜像峰是复数Fourier 变换所固有的
利用窗函数进行变迹处理：相移的正弦钟函数、高斯函数或 平方正弦钟函数
利用正弦钟函数对截尾严重的FID进行修饰，可以消除由于 截尾时的高频截断造成的震荡尾波
F1维的间接采样方式有实数型和复数型两种，F1维的 Fourier变换方式应与采样方式相适应
二维Fourier变换应先变换t2维然后再变换t1维，顺序不可颠 倒
HMBC（异核多重键相关谱）实验
HMQC的严重缺陷：无法判定季碳的化学位移，需要通过长 程耦合来辨认归属
HMBC实验的脉冲序列是以HMQC实验为基础，本质上说是 借助较小耦合常数完成的HMQC实验
由于长程耦合常数之间的差值与耦合常数本身之比很大，旋 进过程中带来的误差就很大，给调整相位带来了很大的困难， 因此一般显示为绝对值谱
两个时间变量t1 t2_－－函数S（t1 ,t2） 两次Fourier变换－－以两个频率为函数的2D-nmr谱 二维NMR实验：通过特殊的脉冲序列来获得自旋核之间各种 信息的。 二维NMR实验的脉冲序列：一般由四个区域组成：预备期 D1（preparation）,演化期t1(evolution),混合期tm和检测期t2 二维NMR实验的关键：是引入了第二个时间变量－演化期t1 二维谱学原理：省略
COSY实验是最简单的二维实验，用途最为广泛， 脉冲序列由两个90o脉冲组成
脉冲序列：90o-t1- 90o-t2 两个时域长度由各维的采样点数和谱宽决定 采样点间隔在谱宽确定以后依照Nyquist采样定律确
定 t1维中，采样间隔表示为Δt1，又称t1增量，也受
Nyquist采样定律制约，由F1维的谱宽决定
未知物结构解析例二(HMBC)
未知物结构解析例二(D交换氢谱)
未知物结构解析答案
未知物一
未知物二
1H-13C HMQC实验检测的就是1H谱中的13C的卫星峰 当样品为天然丰度时，与12C或14N相连的1H主峰需要在实验
中用合适的方法滤去 在4脉冲HMQC实验中，滤去1H主峰是通过相位循环完成的，
一般效率很高 当样品浓度极低时，需要借助BIRD序列增强滤波功能
HMQC脉冲序列
双线性旋转去耦（bilinear rotation decoupling, BIRD）
TOCSY可以将每一个耦合网络用一个方格网 连接起来
脉冲序列为一个90o脉冲加上一串自旋锁定功 能的组合脉冲： 90o-t1- 自旋锁定-t2
旋转坐标系实验（有自旋锁定过程，如 TOCSY和ROESY）和实验室坐标系实验 （无自旋锁定过程，如COSY、DQF-COSY 和NOESY）
NOESY实验
相干转移谱和极化转移谱
基于耦合的相干转移谱：核自旋间的J耦合 （通过原子核间化学键电子的间接作用而发 生的耦合，又称间接耦合），与横向磁化强 度相联系
基于动力学过程的极化转移谱：D耦合（不 需要经过介质的空间相互作用，又称直接耦 合或偶极偶极耦合），与纵向磁化强度相联 系
二维核磁共振实验
一维谱：一个脉冲频率（一个频率）的函数，一个变量， 二维谱：两个独立的变量，nmr信号受这两个变量的影响
维采样时间 二维谱上的精细结构的辨认主要靠F2维的分辨 F1维由于不进行真实采样，没有接收机增益的参数 F2维采用正交的检测方式，F1维有正交复数检测和单通道实数检测两种
方式，应与Fourier变换方式相对应
处理参数的设定
由于F1维采样点的增加从测谱时间上考虑有困难，因此采用 零充填的方法使变换点大于采样点，提高数字分辨率，但是 不能提高谱峰的分辨率，通常信号会出现谱峰拖长的现象