克伦特罗荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究

克伦特罗荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究
李静宇;何小维;刘晓云;李文美;邓建超
【摘要】本研究旨在制备性能优异的克伦特罗(clenbuterol,CLB)荧光免疫层析快速定量检测试纸条,为实现其产业化应用奠定基础.采用荧光胶乳微粒为标记物,以抗原包被浓度、膜干燥时间、混匀反应时间、反应温度及层析时间为单因素优化制备了CLB荧光免疫层析试纸条,并对该试纸条的检测限、特异性、临床准确度及添加回收率、精密度和稳定性进行了评价.最佳制备条件:抗原包被浓度2.0 mg/mL,膜干燥时间5d,混匀反应时间1 min,反应温度25℃,层析时间15 min.评价结果显示,试纸条检测限可达0.35 μg/L;CLB与其他8种同类药物交叉反应率均小于0.8％,特异性良好;各批添加回收率在80％～120％之间,准确度达到要求;不同CLB浓度下变异系数(CV)均小于5％,符合精密度标准;此外,稳定性试验验证了该试纸条稳定性良好.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)010
【总页数】6页(P2606-2611)
【关键词】克伦特罗;荧光免疫层析法;试纸条;快速检测
【作者】李静宇;何小维;刘晓云;李文美;邓建超
【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;广州万孚生物技术股份有限公司,广州510663;华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;广州万孚生物技术股份有限公司,广州510663;广州万孚生物技术股份有限公司,广州510663
【正文语种】中文
【中图分类】R155.5
克伦特罗（clenbuterol，CLB）俗称“瘦肉精”，是一种β－肾上腺素受体激动剂，在畜牧生产中大剂量使用可明显提高瘦肉率［1］。

临床上它可用于治疗人的呼吸道疾病和慢性阻塞性肺病，而且具有一定程度的营养重分配作用［2］。

然而其毒副作用明显，人食用含一定浓度CLB的肉制品时会引发中毒现象，严重时会导致死亡［3－4］。

因此，各国政府明确规定禁止向饲料中添加CLB。

1997年，中国农业部也明文规定禁止在饲料中使用CLB，但实际生活中其非法使用现象仍有发生。

因此建立灵敏度高、简便快速的克伦特罗检测技术在现今社会显得尤为必要。

目前CLB的常用检测方法主要有酶联免疫吸附测定法［5］、气相色谱—质谱法（GC－MS）［6］和高效液相色谱法（HPLC）［7］等。

上述方法尽管灵敏度和准确度高，但费用昂贵、检测方法复杂，且不适于市场现场监督。

筛查方法用的较多的是胶体金法，该法简便快捷、费用较低，已广泛用于食品安全现场初筛检测［8－10］，但该方法在定量检测和灵敏度方面存在不足。

为弥补现有检测方法中检测过程复杂、费用昂贵、灵敏度不高等不足，以荧光微球为代表的发光标记材料已成为免疫层析定量检测的备选标记物，并用于快速检测试纸条的制备［11－13］，但荧光免疫层析法目前还处于研究阶段。

本试验通过荧光免疫层析体系的建立和优化制备了一种具有高灵敏度和特异性的试纸条，并对其检测限、特异性、临床准确度及添加回收率、精密度和稳定性进行了评价，提供了一种快速定量检测CLB的新型方法，为CLB 试剂盒的市场开发奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司；荧光胶乳购自美国Bangs Lab公司；PVC 板购自上海杰一生物技术有限公司；吸水纸购自上海金标生物科技有限公司；CLB、莱克多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸妥洛特罗、盐酸班布特罗、盐酸氯丙那林、盐酸特布他林、酒石酸托特罗定、富马酸福莫特罗标准品均购自中国药品生物制品检定所；猪尿样本采自广州某屠宰场；荧光胶乳微球标记的抗克伦特罗单克隆抗体和羊抗兔IgG 标记抗体通过试验自制；喷膜包被液和标记胶乳稀释液均由广州万
孚生物技术股份有限公司自制。

飞测Ⅱ型荧光定量检测仪购自万孚生物技术有限公司；GS201型切条机购自杭州
峰航科技有限公司；Iso Flow 型喷膜机购自美国Biodot 公司；QL－901型漩涡
振荡器购自长沙英泰仪器有限公司；CP224S型精密电子天平购自德国Sartorius
公司。

1.2 检测原理
CLB免疫层析试纸条的检测采用竞争法，荧光胶乳微粒与CLB 抗体共价结合。

将
检测样本（尿样）加入荧光标记物中，其荧光标记CLB 抗体可与尿液中的CLB结合，形成复合物，而包被在硝酸纤维素膜上检测区（T）的CLB－BSA 偶联物也竞争结合荧光标记CLB抗体。

当含CLB样本与荧光标记物混合后滴加至检测卡的加样孔中，在层析作用下混合液沿着硝酸纤维素膜向前移动，样本中所含CLB量越多，可与T 区CLB－BSA 偶联物结合的荧光标记的抗体越少，从而使T 区测得荧光检出值降低。

通过荧光检测仪扫描T 区荧光信号强度，可检测出样本中CLB含量。

1.3 试验方法
1.3.1 试纸条的制备本研究运用液相的荧光免疫层析方法进行试纸条的制备。

选用
包被抗原浓度、膜干燥时间、混匀反应时间、反应温度、层析时间为考察因素，通过单因素试验优化反应工艺。

具体方法：先将硝酸纤维素膜贴于PVC 板的包被膜区，用包被缓冲液将CLB 包被抗原和羊抗兔IgG 稀释至一定浓度后喷到包被膜的检测带（T 线）和质控带（C线）上，置于50 ℃烘箱中干燥一定时间后密封保存。

随后，在PVC 板上顺次相互搭接样品垫、硝酸纤维素包被膜和吸水纸，用切条机
切割成4mm 宽的试纸条，将试纸条放入卡盖中压紧，备用。

1.3.2 样本检测将待测样品和荧光胶乳微球标记抗体混匀反应一段时间后，取
80μL 混合液滴加至检测卡加样孔中，一定温度下水平放置一段时间后将检测卡插入荧光定量仪中，仪器将自动读取并显示测试结果。

1.3.3 试纸条性能测试检测限：按1.3.2的检测步骤，取20份空白尿液进行测定，先根据标准曲线求出测定值，检测限等于测定值的平均值加上3倍标准差。

特异性：特异性用交叉反应率来表示，在阴性猪尿中添加莱克多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸妥洛特罗、盐酸班布特罗、盐酸氯丙那林、盐酸特布他林、酒石酸托特罗定、富马酸福莫特罗，添加浓度为1 000μg／L，用试纸条进行测试。

交叉反应率计算公式：
临床准确度及添加回收率测试与精密度测试：取10份阴性猪尿样本，每份分别添加1、3、5μg／L 3个浓度的新鲜猪尿配制的CLB标准品，按1.3.2中的方法检测，根据荧光检测仪T／C 值和标准浓度工作曲线计算出检测浓度，检测浓度与添加浓度的比值百分率为回收率，同时计算变异系数（CV），分析精密度。

稳定性：本试验测试试纸条在1年的保存时间是否有效。

按常理，将检测卡置于50℃1个月未变质，相当于室温1年有效，荧光试剂37 ℃放置7d，相当于
4 ℃1年有效。

本试验将检测卡置于50 ℃1个月、荧光标记抗体37 ℃放置7d加速反应后与未加速的试纸条与和荧光标记抗体作对比，考察其稳定性。

2 结果与分析
2.1 荧光免疫层析试纸条工艺条件优化
2.1.1 包被抗原浓度当膜干燥时间5d，混匀反应时间5 min，混匀反应温度25 ℃，层析时间20min时，由图1可知，包被抗原浓度越高，初始信号值越高，荧光信号梯度越明显，综合考虑选择2.0mg／mL为本试验包被抗原浓度。

图1 包被抗原浓度对T／C值的影响Fig.1 Influence of CLB concentration on T ／C value
2.1.2 膜干燥时间当包被抗原浓度2.0mg／mL，混匀反应时间5 min，混匀反应
温度25 ℃，层析时间20 min时，由图2 可知，干燥时间达到5d以后，荧光信
号值随CLB标准品浓度的变化基本趋于稳定，说明干燥已达到平衡，因此选择5d 作为最佳干燥时间。

2.1.3 混匀反应时间当包被抗原浓度2.0mg／mL，膜干燥时间5d，混匀反应温度25 ℃，层析时间20min时，由图3可知，0.5～30min内，T／C值随混匀时间
变化基本保持稳定，从快速检测的角度出发，选择1min为最佳混匀时间。

图2 干燥时间对T／C值的影响Fig.2 Influence of drying time on T／C value
图3 混匀反应时间对T／C值的影响Fig.3 Influence of mixing reaction time
on T／C value
2.1.4 反应温度当包被抗原浓度2.0mg／mL，膜干燥时间5d，混匀反应时间1 min，层析时间20min时，由图4可知，23～27 ℃时T／C 值变化比较稳定，本试验选择25 ℃为最佳反应温度。

图4 反应温度对T／C值的影响Fig.4 Influence of reaction temperature on T
／C value
2.1.5 层析时间当包被抗原浓度2.0mg／mL，膜干燥时间5d，混匀反应时间
1min，反应温度25℃时，由图5可知，反应时间在15min后，测定结果基本稳
定不变，故选择15min为最佳层析时间。

2.1.6 线性关系最优单因素条件下，分别在0、0.5、1.0、2.0、
3.0、
4.0、
5.0μg
／L 标准品浓度下绘制标准曲线。

结果显示线性方程为y=－1.0903x＋1.5936，R2=0.9986，线性良好（图6），可输入荧光定量仪器中作为定量标准使用。

图5 层析时间对T／C值的影响Fig.5 Influence of chromatography time on T
／C value
2.2 荧光免疫层析试纸条性能分析
2.2.1 检测限由表1可知，20份阴性尿样检测结果的平均值为0.05μg／L，标准
差为0.10μg／L，检测限为平均值加上3倍标准差，则此检测方法对猪尿样本的
检测限为0.35μg／L。

图6 克伦特罗标准曲线Fig.6 Standard curve of CLB
表1 阴性尿样检测结果（n=20）Table 1 Negative urine detection result
（n=20）样本编号测定浓度（μg／L）样本编号测定浓度（μg／L）Samples No.Determinable concentrationSamples No.Determinable concentration 1
0 11 0.238 2 0 12 0 3 0 13 0 4 0 14 0.260 5 0 15 0 6 0 16 0 7 0 17 0 8 0 18 0 9 0.234 19 0.269 10 0 20 0
2.2.2 特异性由表2可知，各药物添加浓度为1 000μg／L时CLB与其他8种同
类药物交叉率均小于0.8%，表明其特异性良好。

2.2.3 临床准确度及添加回收率分析与精密度分析由表3可知，猪尿中添加1、3、5μg／L高、中、低浓度CLB 标准品的平均回收率均在80%～120%之间，准确度符合要求，平行测定样本的变异系数均小于5%，精密度符合要求。

2.2.4 稳定性由图7可知，50 ℃加速1个月的试纸条与37 ℃加速7d荧光标记抗体反应和未经加速的试纸条与荧光标记抗体之间，标准曲线低端浓度点存在偏差，高端浓度点基本拟合。

荧光标记抗体与试纸条破坏后测试，稳定性良好。

表2 交叉反应测试Table 2 Cross－reaction test添加药物Added drugs 反求浓度（μg／L）Reverse concentration 交叉反应率（%）Cross－reactivity莱克多巴胺Ractopamine 1.75 0.17硫酸沙丁胺醇Salbutamol sulfate 7.44 0.74盐酸
妥洛特罗Tulobuterol hydrochloride 7.47 0.74盐酸班布特罗Bambuterol hydrochloride 7.75 0.77盐酸氯丙那林Clorprenaline hydrochloride 7.11 0.71盐酸特布他林Terbutaline hydrochloride 7.17 0.71酒石酸托特罗定Tolterodine tartrate 1.72 0.17富马酸福莫特罗Formoterol fumarate 1.76
0.17
表3 添加回收试验与精密度测定试验结果（n=10）Table 3 The results of added recovery and degree of precision（n=10）添加浓度（μg／L）Added concentration 1 3 5反求浓度平均值（μg／L）Average value of reverse concentration 1.01 2.78 4.26平均回收率（%）Average recovery 101.16
92.78 85.29变异系数（%）CV 3.70 2.26 1.62
图7 稳定性分析Fig.7 Stability analysis
3 讨论
目前CLB的常用检测方法包括酶联免疫吸附测定法、气相色谱—质谱法（GC－MS）和高效液相色谱法（HPLC）、胶体金法等，其中应用最多的是胶体金法［14］。

常用检测方法中存在灵敏度不高或检测方法昂贵、复杂等缺陷，不能较
好地满足市场需求。

而荧光免疫层析法是目前正在发展中的一种新的免疫学检测技术，也可用于克伦特罗的快速定量检测。

荧光免疫层析法的荧光物质主要有荧光素、生物蛋白及一些荧光胶乳微粒。

新型的荧光微球还能进一步提高免疫层析方法的灵敏度。

该方法在食品安全检测应用方面的研究已有报道，且其灵敏度是胶体金法的5～10倍［15］。

本试验以荧光胶乳微粒作为标记物，利用荧光免疫层析平台筛
选出合适配对的抗原、抗体，通过对抗原包被浓度、膜干燥时间、混匀反应时间、
反应温度、层析时间等条件的考察制备出了CLB荧光免疫层析试纸条，并对试纸
条的检测限、特异性、临床准确度及添加回收率、精密度和稳定性进行了评价。

试验条件下荧光免疫层析试纸条的最佳工艺条件为：包被抗原浓度2.0mg／mL，膜干燥时间5d，混匀反应时间1min，反应温度25 ℃，层析时间15 min。

测试试
纸条对克伦特罗检测限达到0.35μg／L，具有较高的检测灵敏度；克伦特罗与8
种同类药物交叉反应率均小于0.8%；高、中、低3个浓度CLB 标准品的平均回收率均在80%～120%之间，平行测定样本的变异系数均小于5%。

稳定性试验结果表明试验制备的试纸条具备较好的稳定性。

葛怀礼等［16］基于免疫荧光层析原
理对盐酸克伦特罗试纸条的性能展开了研究。

而本研究在试纸条的制备及检测过程中从单因素的角度展开了详细的研究，结果表明该试纸条能实现对CLB的快速检测，检测过程快速简便。

对试纸条性能的详细研究表明，该试纸条具有较高的灵敏度、精确度及稳定性。

然而目前该方法还处于研究阶段，检测标准有待规范，还需专门检测机构、研究单位的更多研究与评估。

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