嗜酸乳杆菌培养条件的优化及菌株鉴定

收稿日期:2007-10-21

基金项目:河南科技学院重点资助项目;大学生创新基金项目

作者简介:牛生洋(1976-),男,甘肃张掖人,讲师,主要从事食品微生物研究。

嗜酸乳杆菌培养条件的优化及菌株鉴定

牛生洋,李　刚,赵瑞香,李　岩

(河南科技学院食品学院,河南新乡453003)

摘要:从肠道分离嗜酸乳杆菌,以MRS 培养基作为基础培养基,对不同浓度的增殖因子进行筛选,得到了最优的培养基:基础培养基+5%番茄汁+0.3%肝浸汁(pH =6.4)。合成嗜酸乳杆菌l6S r RNA 的特异性引物,并建立了

PCR 方法从分子水平对其进行鉴定,为嗜酸乳杆菌的深入研究奠定基础。

关键词:嗜酸乳杆菌;培养;PCR

中图分类号:T Q927 文献标识码:A 文章编号:167326060(2008)0120073202

The Study of O pti m a l Culture Cond iti on and I den ti f i ca ti on of Lactobac illus Ac i doph ilus

N iu Shengyang,et al .

(Henan I nstitute of Science and Technical,Xinxiang 453003,China )

Abstract:Lact obacillus acidophilus was is olated fr om bacteriu m in intestinal tract .Acidophilus,Based on theMRS medi 2

u m ,the op ti m al mediu m was obtained by test consisted of t omat o juice 5%and liver infusi on 0.3%(pH =6.4).The meth 2od for identificati on was established by PCR using p ri m er of l6S r RNA in Lact obacillus acidophilus .

Key words:Lact obacillus acidophilus;cultivati on;PCR

嗜酸乳杆菌(L adobacillus acidophilus )是人体肠

道内的少数有益菌之一,它因有改善调节肠道微生物菌群的平衡、增强机体免疫力、降低胆固醇水平、缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等功效[1,2]而倍受关注。嗜酸乳杆菌发酵乳和用于治疗的乳酸菌制剂,在欧洲等地区被广泛利用。但我国对其研究较少。因此,本试验对嗜酸乳杆菌进行了分离,对其培养条件进行了优化并采用PCR 技术进行了鉴定,以企为嗜酸乳杆菌的深入研究奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株　嗜酸乳杆菌由肠道进行分离。

1.1.2　培养基　MRS 培养基参照文献方法

[3]

进行

配置,培养基增殖因子鲜番茄、新鲜猪肝均从当地市场采购。1.1.3　试剂　Taq 酶,d NTP 和上样缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司,100bp DNA ladderMark 2er 、饱和酚、溶菌酶、蛋白酶K,S DS,Tris 碱、琼脂糖(电泳用)、EDT A 等购自天根生化科技(北京)有限

公司。

1.2　方法1.

2.1　培养基的优化选择　给MRS 培养基中加入不同浓度梯度的番茄汁和肝浸汁,再配合不同的培养基pH,进行培养基的优化选择。1.2.2　菌落计数　在培养基上培养10h,使菌落处

于对数生长期,根据国际乳品联合会标准[4]

,采用MRS 培养基配方平板计数。1.2.3　嗜酸乳杆菌基因组DNA 提取　取对数期的嗜酸乳杆菌的菌液5mL,采用改良CT AB 法提取基因组DNA ,TE 溶解,用紫外分光光度计法和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 的纯度,并估计

其含量,稀释DNA 样品至50ng/

μL.1.2.4　PCR 鉴定嗜酸乳杆菌　根据文献报道[5]

的引物序列,由上海英骏生物技术有限公司合成,超纯水溶解引物,-20℃保存。其PCR 反应体系:总

体积20

μL,其中10×buffer (含20μmol/L Mg 2+)2.0μL,10mol/L dNTPs 0.4μL,10μmol/L 上、下游

引物各0.4

μL,模板DNA 50ng,2U Taq DNA 聚合酶3

7第36卷　第1期Vol .36　No .1河南科技学院学报(自然科学版)

Journal of Henan I nstitute of Science and Technol ogy 2008年3月Mar .2008

0.25μL,超纯水15.55μL.PCR反应条件:预变性95℃3m in,然后变性94℃30s,复性60℃30s,延伸72℃30s,34个循环,最后延伸10m in.PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,150V电泳30m in,紫外成像系统下照像,分析结果。

2　结果与分析

2.1　培养基的优化选择

给MRS培养基中加入不同浓度的番茄汁和肝浸汁作为增殖因子,再配合不同的pH,进行菌落计数,其结果如表1所示。由此结果看出,番茄汁和肝浸汁对嗜酸乳杆菌的培养起到增殖作用;通过表中的5种培养基进行筛选,其最佳的培养基为第四组,即MRS培养基和增殖因子的5%番茄汁+0.3%肝浸汁,其培养的条件是pH为6.4.

表1　培养基和pH对菌数的影响　(109/mL)

pH

6.2 6.4 6.6 6.8

MRS培养基 3.9 4.5 4.4 3.7 5%番茄汁+0.1%肝浸汁 4.1 5.2 5.0 3.8

5%番茄汁+0.2%肝浸汁 4.6 6.0 5.6

4.3

5%番茄汁+0.3%肝浸汁 5.27.6 5.8 4.6

5%番茄汁+0.4%肝浸汁 4.9 5.9 5.3 3.9

2.2　PCR检测结果

用建立的PCR方法对嗜酸乳杆菌分离株检测结果表明,扩增出与嗜酸乳杆菌参考株一致的条带,均获得约509bp的片段,表明分离菌为嗜酸乳杆菌。结果见图1.3　结论与讨论

3.1　MRS培养基+5%番茄汁+0.3%肝浸汁,使其pH=6.4,可作为嗜酸乳杆菌培养的最佳培养基。番茄汁和肝浸汁对嗜酸乳杆菌的生长有较明显的促进作用,与陈小梅等研究结果一致[6]。因为:(1)番茄汁不仅能为嗜酸乳杆菌提供碳源,而且含有乳酸菌生长不可缺少的核苷酸和矿物质;(2)肝脏中含有尼克酸、叶酸、钴胺酸、吡哆酸等营养物质,且它们在中性及微酸性环境中对热稳定,因而这些营养物质都促进了乳酸菌的生长;(3)嗜酸乳杆菌和其他的菌一样,对环境,特别是pH有严格的要求,本实验所提供的pH正好满足了嗜酸乳杆菌生长的最佳条件。

3.2　PCR技术可作为嗜酸乳杆菌鉴定的主要手段。随着分子生物学技术的迅猛发展,PCR技术已经渗透到了整个生命科学领域。与其他的鉴定方法相比,PCR方法快速、特异性强,灵敏度高。本实验通过对PCR体系和反应条件的优化,建立了快速鉴定嗜酸乳杆菌的方法,为嗜酸乳杆菌的深入研究奠定了基础。

参考文献:

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技信息,2006(2):58-59.

[2]　张　帆,王建华,刘立恒,等.嗜酸乳杆菌的培养条件

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43-46.

[3]　龚广予,王　颖,顾其芳.嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和干

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24(2):19-21.

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[5]　颜世敢.鸡源嗜酸乳杆菌的分离、鉴定及应用[P].南

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[6]　陈小梅,张迅捷,罗建玲,等.嗜酸乳杆菌增菌培养研

究[J].四川食品与发酵,2004,40(2):40-42.

(责任校对:赵坤)

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2008年 河南科技学院学报(自然科学版)