肿瘤的分子生物学检验(精品课件)

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6、基因芯片
集成化的核酸分子杂交技术
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谢谢
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9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定 。20.10. 1820.10 .18Sunday, October 18, 2020
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10、低头要有勇气，抬头要有低气。1 6:28:14 16:28:1 416:28 10/18/2 020 4:28:14 PM
– 1981年 Bast
CA125（OC125）
• 第3阶段（1990以后）：基因标志
– 肿瘤基因标志
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一、原癌基因(oncogene，onc)及其表达产物的作用
1、定义： 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）
固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生 物特征的基因总称。原癌基因包括病毒癌基因（v-onc） 和细胞癌基因（c-onc）两种，它们在正常情况下以非激 活的形式存在，故称原癌基因。负责调控正常细胞的生 命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期 进展、细胞存活以及DNA转录等。一旦这类基因发生某 些错误或功能丧失时，极易导致原癌基因转变为可使正 常细胞转化为肿瘤的转化基因或癌基因。
后凋亡（apoptosis）—抑癌基因
两种信号保持着动态平衡，对正常细胞的生长、 增殖、死亡精确地调控，当平衡被破坏，正调控信 号基因功能过盛或负调控信号基因失活，导致细胞 增殖调控的混乱而使细胞恶变
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原癌基因的激活 1、ras基因的变异 2．myc基因的变异
抑癌基因的失活 1、Rb基因的失活 2、p53基因的失活 3、其他：
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4、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)
在设计引物时应使被扩增的靶基因片段的两端含有不同的Tm值，一端较高，另 一端相对较低。将PCR产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行 分离，当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片段中Tm值较低一端的双链 被部分变性而解链，这种部分解链的构象致使该片段的电泳迁移率大大降低。
BRCA1和BRCA2：与遗传性高发乳腺癌相关的基因， 与卵巢癌的发生也紧密相关
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五、检测方法： 1、PCR／ASO探针法(PCR-allele-specific oligonucleotide）
被检基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经 标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交。由于长 度为20个碱基左右的探针中仅1个碱基的差异便会使其Tm值下降 5.0~7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可以使PCR产物与完全 互补的探针进行杂交，也即野生型序列的产物仅与野生型探针杂 交，含突变序列的产物仅与突变探针杂交。根据有无杂交信号可 判断被检扩增片段中是否带有突变点。
mutation
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(二)原癌基因获得外源启动子而激活 肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的
mRNA或翻译产物蛋白质的含量来表示 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激
活原癌基因，使其表达产物增多 病毒的增强子常位于5’端的长末端重复序列(1ong
terminal repeat，LTR)内。如果增强子插入到原癌基 因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的表达比 正常表达增高几十甚至上百倍
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（2）作用： 不同程度磷酸化后，都可使p105活性缺乏或完全
消失。非磷酸化的Rb可防止细胞增殖，当DNA肿 瘤病毒抗原结合了非磷酸化的Rb时，Rb的活性就 受到抑制，使细胞转化为无限增殖状态，形成肿瘤
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对于大量来自视网膜母细胞瘤的Rb基因序列进行分析， 发现Rb基因完全或部分发生缺失；另一些Rb肿瘤中， 基因完整，但序列分析显示有一个突变，它常发生于 剪接点上，由于这一变异导致Rb mRNA组装时有外显 子被漏掉，因而产生异常Rb蛋白质
Baidu Nhomakorabea
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野生型p53的蛋白质
p53下调bcl-2而上 调bax，促进细胞凋 亡过程。向丢失p53 等位基因的肿瘤细胞 中导入野生型p53就 会使肿瘤细胞凋亡
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正常细胞的生长增殖由两大基因调控 正调控信号：促进细胞生长和增殖，并且阻止
其发生终末分化—癌基因 负调控信号：促进细胞成熟，向终末分化，最
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三、原癌基因的激活机制 原癌基因具有正常的生理功能，被激活时又具有
致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。 现已证实 射线辐射 化学致癌剂 病毒感染
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(一)原癌基因点突变(point mutation) 癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发
生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化， 从而获得了转化细胞的活性
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(三)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)对阻抑基因的转
录具有重要作用
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现已发现在结肠腺癌和小细胞肺癌的细胞中，ras基因 的DNA甲基化水平比其邻近的正常细胞明显偏低，提 示某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活
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(四)原癌基因的拷贝数增加
基因扩增(amplification)： 某些癌基因通过一些机制在原来的染色体上复制多
个拷贝，超出了正常细胞的癌基因剂量，导致基因产 物的增加，从而使细胞正常功能紊乱
例如： 人视网膜母细胞瘤：N-myc扩增了10-200倍，相应的
mRNA和蛋白质产物也都大量增加
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11、人总是珍惜为得到。20.10.1816:2 8:1416: 28Oct-2 018-Oct -20
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12、人乱于心，不宽余请。16:28:1416 :28:141 6:28Sunday, October 18, 2020
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13、生气是拿别人做错的事来惩罚自 己。20. 10.1820 .10.181 6:28:14 16:28:1 4October 18, 2020
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(五)基因易位或重排使原癌基因激活
基因易位（translocation） 基因重排（rearrangemant）：
有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染色 体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相对 静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著增 加而导致肿瘤的发生
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染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染 色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋 白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性 大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生
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基因1 基因2 原癌基因 M W 肿瘤 抑癌基因 M W
M M 肿瘤
抑癌基因又称为隐性癌基因
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（2）p53基因 ★特点：17p13，11个外显子，10个内含子 ★编码：393个氨基酸，p53
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★作用：产物能结合DNA和被磷酸化。 （1）抑制肿瘤细胞停滞在修复前期不能进入S期复制DNA 而促使细胞凋亡
肿瘤的分子生物学检验
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肿瘤标志物的研究历史
• 第1阶段（1963-1978）：癌胚性抗原
– 1963年 Abelev
AFP
– 1965年 Gold & Freeman CEA
• 第2阶段（1979-1989）：糖链抗原为主
– 1980年 Koprowski
CA19-9（1116-NS-19-9）
由于野生序列与突变序列的PCR产物片段的Tm不同，它们在电泳过程中被部分解 链的先后不同，经过一定时间的电泳，可以发现这些产物片段在凝胶中所处 的位置也不同，据此，可以区别野生序列片段还是突变序列片段。
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5、Southern Blot
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互 补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分 离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原 位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交， 用放射自显影或酶反应显色。
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细胞癌基因的作用： 通过其表达产物蛋白质来体现的，负责调控正常细胞的生 命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进 展、细胞存活以及DNA转录等。
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二、癌基因
定义：原癌基因在进化上高度保守，负责调控正常细胞的生命 活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细 胞存活以及DNA转录等。一旦这类基因发生某些错误或功能丧失 时，极易导致原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤的转 化基因或癌基因
生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关，只是抑癌 基因给予细胞的信号与原癌基因相反
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（二）抑癌基因失活机理
1、视网膜母细胞瘤(retino-blastoma，Rb) （1）特点： ★基因组成：27个外显子，3-17外显子区域是基
因重组和突变的热点
★编码：p105的蛋白质，其有结合DNA的活性， 可受多种激酶系统催化而发生磷酸化
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2、限制性片段长度多态性(RFLP)分析
聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR— RFLP）分析技术是在PCR 技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识 别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特 异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝 胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR— RFLP，可 检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传
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四、抑癌基因
抑癌基因(suppresser gene)又称抗癌基因(anti-onc)，
是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，并有潜 在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起 细胞恶性转化而导致肿瘤的发生
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（一）抑癌基因及其表达产物 抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能与
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17、一个人即使已登上顶峰，也仍要 自强不 息。下 午4时28 分14秒 下午4 时28分1 6:28:14 20.10.1 8
谢谢大家
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14、抱最大的希望，作最大的努力。2 020年1 0月18 日星期 日下午4 时28分 14秒16 :28:142 0.10.18
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15、一个人炫耀什么，说明他内心缺 少什么 。。202 0年10 月下午4 时28分 20.10.1 816:28 October 18, 2020
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16、业余生活要有意义，不要越轨。2 020年1 0月18 日星期 日4时28 分14秒 16:28:1 418 October 2020
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2、特点： （1）v-onc是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，能
引起细胞转化 （2）c-onc是存在于正常细胞基因组中的癌基因，
在正常情况下处于静止或低表达的状态，不 仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具 有重要作用，但在异常表达时，其产物可使 细胞无限制分裂
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细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性即它 们的DNA序列是相对应的，表达产物也基本相 同
标记进行连锁分析进行间接基因诊断。
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3、PCR-SSCP、测序等
➢ 单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成 ➢ 突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链
➢ 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁 移率，从而能区别正常与突变的DNA