包涵体表达的蛋白的复性(综述)

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包涵体表达的蛋白的复性

外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成,虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点,但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。

一、包涵体:

1.1包涵体的定义、组成与特性:

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5-1um,具有很高的密度(约1.3mg/ml),无定形,呈非水溶性,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构,他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1]

1.2包涵体的形成:

主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子,或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.2.1、基因工程菌的表达产率过高,超过了细菌正常的代谢水平,由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和,使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二

硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。

1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

1.2.3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子,如折叠酶和分子伴侣等,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。

1.2.5、蛋白质在合成之后,于中性pH或接近中性pH的环境下,其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键,即是说,有的表达产率很高,如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体,而以可溶形式出现。[2]

1.2.6、在细菌分泌的某个阶段,蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。

1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解

1.3.1基因工程菌发酵液,经离心浓缩后,可用:机械破碎、超声破碎:单纯超声破碎,在小规模下且菌量较少的情况下效果较好,由于能量传递和局部产热等原因,很难用于大体积细胞悬液的破碎,这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起,给后期纯化带来困难。因此,在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜,再结合超声破碎方法,可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂

解,然后以5000-20000g15min离心,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。

1.3.2洗涤:为了除去包涵体上粘附的杂质,如膜蛋白或核酸,应用洗涤液洗涤包涵体,通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解,如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。[3]

1.3.3溶解:一般用强的变性剂如尿素(6-8M)、盐酸胍(GdnHCl 6M),通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,一般来讲,盐酸胍优于尿素,因为盐酸胍是较尿素强的变性剂,它能使尿素不能溶解的包涵体溶解,而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化,特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂,如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT,也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下,可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关,而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响,如牛生长激

素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶,有时还原剂的使用也是必要的,可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。[4]

二、复性:

由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性,加上剧烈的处理条件,使蛋白的高级结构破坏,因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到2M左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从4M开始,到1.5M时复性过程已经结束。

2.1包涵体蛋白复性方法

2.1.1稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

2.1.2透析复性:好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成无活性蛋白质聚体,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。

2.1.3超滤复性:在生产中较多的使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

2.1.4柱上复性:是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法,包涵体蛋白变性后,在色谱柱上复性,大致可分成疏水柱复

性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75等分子筛填料,柱较长(40cm-100cm不等)。相比稀释和透析两种方法,色谱柱复性回收率高(高达90%以上)、快速、易放大,样品稀释倍数小(一般五倍左右)[5]

2.1.5高蛋白质浓度下的复性:通常有两种方法,一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性;二是采用温度跳跃式复性,即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成,当形成聚集体的中间体已经减少时,迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。

此外,吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。

2.2包涵体蛋白复性效率

复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白质复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白质本身的性质有关,有些蛋白非常容易复性,如牛胰RNA酶有12对二硫键,在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11,很多蛋白的复性效率只有百分之零点几,如在纯化IL-2时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子(0.05%SDS,7.5-30u mol/l CuCl2)的方法,25-37°C下反应3小时,再EDTA至1m mol/l终止反应,复性后的二聚体低于1%。[6]一般说来,蛋白质的复性效率在20%左右。

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