诊断试剂盒

结核性胸腔积液特异性诊断试剂盒的研制

一、项目可行性报告

（一）立项的背景和意义。

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的以呼吸道传播为主的慢性传染病，是当今世界由单一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病，严重威胁着人类的健康。特别是近10年来由于人口剧增、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、免疫抑制剂的使用等原因，结核病日益严重，全球结核病疫情骤然回升。据资料报道，当前全球1/3的人感染了结核杆菌，每年有800万至1000万新发结核病患者，有300万人死于结核病[1-4]。我国的结核病流行情况十分严峻，结核病人数位居世界第二位，约占全球结核病人的四分之一，是全球22个结核病高负担国家之一，每年由结核病带来的直接经济损失超过40亿。2000年在我国31个省、直辖市、自治区组织进行第四次全国结核病流行病学抽样调查，结果显示全国人口结核感染率为45%，高于WHO估计的1/3水平，估计全国结核菌感染者5.5亿。农村结核患病率高于城市，西部地区患病率高于东部地区。全国现有活动性肺结核病人451万，菌阳肺结核病人196万，每年死亡人数约13万，在传染病中居第一位，是其它各种传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍，结核病的发病数和死亡数自2005年初以来居27种甲乙类传染病首位，结核病已经超过肝炎一跃成为我国危害最严重的传染病。因此在全国范围内采取有效遏制结核病的策略刻不容缓[5-8]。

（二）国内外研究现状和发展趋势。

由于结核主要通过飞沫传播，因此结核病的早期诊断非常重要，利用简单、快速、准确的实验室检查尽早对结核病做出诊断对控制结核病疫情至关重要。然而目前，结核病的诊断现状不尽人意，体外分枝杆菌分离培养是诊断结核病的金标准，其缺点是：培养周期长（约6周），假阳性率高[9]。近年来应用于临床的Bactec分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统可将阳性标本检出时间缩短至平均9天，鉴定、药敏试验时间平均为4天，然而Bactec仪器价格昂贵，需进口厂家的专利液体培养基，费用较高，且方法仍然建立在以细菌培养的基础之上，不管是检测菌体还是检测代谢产物，都要通过分枝杆菌的自然生长以积累菌量方能检出，而分枝杆菌的生长相对缓慢，因而它们都难以突破“慢”的限制[10]。结核病诊断的免疫学检测，目前仍普遍基于感染免疫学的概念检测结核菌抗原及其特异性抗体，国内外研究者采用脂阿拉伯甘露聚糖(LAM) 、脂多糖(LPS) 、结核菌重组蛋白相对分子量38 000 等或其他纯化蛋白作为抗原，以胶体金标记，建立简便、快速免疫学诊断方法，如分子量

38 000的金标渗滤试剂以及结核特异性抗原免疫印迹检测技术。但是，由于结核菌在属间和种间存有共同的抗原决定簇，加之其与体液免疫的相关性目前尚未得到充分的阐明，因而在综合提高实验的敏感性和特异性方面未能取得实质性的进展[11-13]。结核病免疫学检测，目前最常用的是PPD试验，以机体对注射的PPD 是否产生变态反应来判断机体曾否感染过结核菌而作为一项辅助诊断指标。但是，由于PPD中含有许多分支杆菌共同的抗原，如卡介苗接种者PPD 试验可呈现阳性结果，PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌复合群感染还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。PPD皮试诊断的特异性差，用该方法进行结核病流行病学调查获得的结核分支杆菌感染率并不能真正反映人群中结核分支杆菌感染的实际状况。重症肺结核病人则往往因为机体免疫力低下而呈现阴性结果等情形，都大大降低了其临床价值[14]。另外，近年来发展起来的分子诊断技术如PCR、PCR-RFLP、real-time PCR以及基因芯片技术，大多数需要数小时才可以得到结果，且这些技术需要昂贵的仪器，存在假阳性和假阴性的问题，对实验室硬件和检测人员素质要求较高，故非常不适用于现场的快速检验、早期排查和诊断[4, 15, 16]。

时间分辨荧光分析法（time resolved fluoroimmunoassay, TRFIA）是近十年发展起来的一种微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术，灵敏度完全可与放射免疫分析技术相媲美，甚至超过放射免疫分析的水平。时间分辨荧光分析法实际上是在荧光免疫分析（fluorescent immunoassay, FIA）的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。在通常的荧光分析中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光（来自胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光、血清蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光）强度大，干扰强，成为荧光分析法大范围推广使用的瓶颈。时间分辨荧光免疫分析法可以有效的解决这一难题。它的基本原理用镧系金属离子（如Eu3+、Sm3+、Tb3+、Dy3+）作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，镧系元素作为示踪剂有以下特点：①荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差，称为Stokes位移。普通荧光物质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。镧系元素Stokes位移达200nm，很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰；

②镧系元素与普通的荧光团比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间长，为传统荧光的103～106倍，镧系元素的荧光半衰期介于10～1 000μs之间。这样，用时间分辨荧光仪测量镧系元素的荧光时，在脉冲光源激发之后，可以适当的延迟一段时间，待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量，这时就只存镧系元素标记物的特异性荧光。通过时间延迟和波长分辨，极大地降低了本底荧光。待反应(如抗原抗体免疫反应、

生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，即可推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA具有以下优点：①灵敏度高，检测下限为1pmol，达到或超过放射免疫分析水平；②线性范围宽，可达6个数量级，远远宽于ELISA的线性范围，也超过化学的线性范围；③不受样品中自然荧光干扰，背景低；④可多重标记（如两种不同的抗原可分别用Eu3+、Sm3+标记），一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目；⑤操作简便、易自动化，标记物制备简便且稳定，无放射性污染。由于TRFIA技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，同时又克服了它们的局限。因此，TRFIA是一种公认的继RIA、EIA之后最有发展前途、值得推广的非放射免疫标记技术，目前已经成为基础医学研究和临床治疗监测等方面的重要手段[17-19]。

近年来，人们对结核分枝杆菌培养的滤液进行了深入的研究，分离出了多种分泌蛋白，如MPT64、PT70、MPT63、MPT53、Ag85、CPF10和ESA T6[20]。其中，结核杆菌培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10, CFP10) 和早期分泌性抗原靶6(early secretory antigenic target-6, ESAT6)为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有，卡介苗（BCG）及非致病分枝杆菌缺乏。CFP10与ESA T6同属于ESA T6家族，且由同一操纵子调控，产生的蛋白能诱导机体产生强烈的免疫应答[21-24]。ESAT6分子量很小，仅6KD，难于用双抗夹心法进行检测。本研究采用时间分辨荧光免疫分析双抗夹心技术，建立了定量检测CFP10的方法，初步临床试验结果表明，CFP10用于结核患者血清检测敏感性较低，但用于结核性胸腔积液的诊断敏感性在80%以上，特异性达100%，是一个非常有开发潜力的结核病新型诊断试剂盒，可以有效地鉴别诊断结核性、癌性和其他感染性胸腔积液。

参考文献：

[1] Miller TL, McNabb SJ, Hilsenrath P, et al. Personal and societal health quality lost to tuberculosis. PLoS ONE. 2009. 4(4): e5080.

[2] Otero L, Krapp F, Tomatis C, et al. High prevalence of primary multidrug resistant tuberculosis in persons with no known risk factors. PLoS One. 2011. 6(10): e26276.

[3] Luncă C, Enache E, Olaru SP, et al. Monitoring of Mycobacterium tuberculosis infections in Iasi County in 2009. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2011 Jul-Sep;115(3):718-22.

[4] Asiimwe BB, Joloba ML, Ghebremichael S,et al. DNA restriction fragment length polymorphism analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates from HIV-seropositive and