杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成关键基因PsIPPI和PsCPT的克隆及功能分析

杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成关键基因PsIPPI和PsCPT

的克隆及功能分析

天然橡胶是事关国民经济和国家安全的一种重要战略物资,主要成分为顺式-1,4-聚异戊二烯。巴西橡胶树(Hevea rasiliensis Muell.Arg)是目前天然橡胶原料的主要来源,由于受到该树种热带生长特性限制,我国种植面积有限,产能严重不足,开发新的天然橡胶资源已成为我国迫切需要解决的问题。

本研究首先从分析具有天然橡胶生产能力的植物入手,选择了杠柳(Periploca sepium Bunge)作为我国生产天然橡胶替代植物的研究对象;然后通过转录组测序等生物信息学手段,明确了杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成途径的关键酶系及其所编码的基因;利用基因的表达调控技术阐明了部分关键基因在杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成中的作用。本研究的研究结果如下:1.以杜仲聚异戊二烯提取得率以及分子量分布为衡量标准,通过对材料预处理、提取方法进行比较,确定了有效的聚异戊二烯分析测定方法。

结果表明采用氯仿作为有机溶剂,在水浴下采用索氏提取杜仲聚异戊二烯的方法最佳,在提取过程中使用超声波辅助处理,可以进一步促进小分子或大分子的聚异戊二烯聚合物的溶出,提取更加充分。2.以三种广泛分布于我国西北、东北和华北等干旱、半干旱地区的野生灌木或草本植物,含乳汁成分的鹅绒藤(Cyanchum chinense R.Br.)、罗布麻(Apocynum venetum L.)以及杠柳为材料,进行聚异戊二烯提取和分析。

通过对提取物进行凝胶渗透色谱(GPC)分子量分析以及核磁共振(NMR)结构分析,发现杠柳中含有顺式-1,4-聚异戊二烯成分,可作为生产天然橡胶原料的替代植物加以研究。3.以杠柳的叶片、枝条和树皮为材料,提取RNA进行转录组测

序分析,从中筛选出杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯生物合成途径的相关酶类及其编码的基因,即杠柳异戊烯基二磷酸异构酶(PsIPPI)、牻牛儿基二磷酸合酶(PsGPPS)、法尼基二磷酸合酶(PsFPPS)、双牻牛儿基二磷酸合酶(PsGGPPS)及顺式-异戊烯基转移酶(PsCPT)及其基因,并进行了生物信息学分析。

4.根据转录组测序结果选择了杠柳顺式-聚异戊二烯生物合成途径中的两个关键基因,即PsIPPI和PsCPT,利用PCR方法全长克隆,并以单独或组合的形式构建成三种基因过表达载体,以鉴定这两个基因的功能以及对杠柳顺式-聚异戊二烯生物合成的影响。

5.利用农杆菌介导方法将这三种基因过表达载体导入到杠柳植物体内进行过表达。

结果发现在杠柳中过表达PsIPPI基因对其顺式-1,4-聚异戊二烯的生物合成没有明显作用;过表达PsCPT基因对顺式-1,4-聚异戊二烯的生物合成具有明显的提升,增加约5倍;而同时过表达PsCPT基因及PsIPPI基因能更进一步促进杠柳顺式-1,4-聚异戊二烯的生物合成,特别是高分子部分。该研究将为培育杠柳成为生产天然橡胶工业原料替代植物,为解决我国天然橡胶贫乏的工业瓶颈、丰富橡胶资源提供技术支撑。