EcoliO157H7LAMP检测方法的建立

E.coli O157:H7LAMP检测方法的建立

朱海吕敬章范放洪小柳马淑棉黄李华刘慧玲

[摘要]目的建立检测E.coli O157:H7环介导的等温扩增方法（LAMP）。方法选取E.coli O157: H7的rfbE基因设计LAMP引物，优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行了检测。结果所建立的E.coli O157:H7LAMP体系具有良好的特异性，用该体系对9属13种41株菌进行检测，结果只有E.coli O157:H7的扩增产物电泳结果为阶梯状条带，非E.coli O157:H7均未产生扩增产物，灵敏性为2.7×101CFU/mL。样品及培养基对反应体系没有影响或影响很小。对76份样品进行了检测，E.coli O157: H7LAMP检测方法与国标法的总符合率为96.1%，2h内即可完成检测。结论本研究建立的E.coli O157: H7的LAMP法不但解决了分子生物学检测对实验室仪器设备的高要求问题，而且检测方法简便、快捷，非常便于基层实验室和现场检测使用。

[关键词]环介导的等温扩增；E.coli O157:H7；rfbE

Development of loop-mediated isothermal amplification(LAMP)method for detection of E.coli O157:H7

ZHU Hai,LV Jingzhang,FAN Fang,HONG Xiaoliu,MA Shumian,HUANG Lihua,LIU Huiling （Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangdong,Shenzhen518067,China）

[ABSTRACT]Objective To establish a method of loop-mediated isothermal amplification(LAMP)for detection of E.coli O157:H7.Methods A set of four primers including two outer and two inner primers which specifically to recognize the rfbE gene of E.coli O157:H7was designed.The LAMP reaction mix was optimized.To compare with standard method(GB/T4789.36-2008),76samples were tested.Results The LAMP assay correctly identified27E.coli O157:H7strains,but14non-E.coli O157:H7strains.Sensitivity of the LAMP assay for direct detection of E.coli O157:H7in pure cultures and in spiked chicken samples was2.7×101CFU/mL.With this method, the detection of E.coli O157:H7can be finished in less than2hours.The coincidence between LAMP and standard method are96.1%.Conclusion The LAMP assay is a sensitive,rapid and simple tool for the detection of E.coli O157:H7and will facilitate the surveillance for control of contamination of E.coli O157:H7.

[KEY WORDS]Loop-mediated isothermal amplification;E.coli O157:H7;rfbE

环介导的等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新的核酸等温扩增技术[1,2]。其原理是针对目的片段上的六个位点设计四条引物（一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP），在Bst DNA聚合酶的作用下，将目的片段在等温条件下（60℃～65℃）进行无限长扩增，其产物是众多大小不一的DNA 片段的混合物。因LAMP扩增过程中会有焦磷酸镁沉淀产生，因此，其产物可以通过比浊或者肉眼直接观察来判定有没有扩增发生。相对于传统PCR，LAMP具有高特异性、高灵敏性、易于开展等特点，因此，该技术一经推出就备受关注。截止目前，该技术已经被应用于病毒[3～6]、细菌[7～11]、寄生虫[12～14]、癌症[15]、物种鉴定[16]、胚胎性别鉴定[17]等的检测。

本项目利用LAMP技术建立了检测E.coli O157: H7的快速检测方法，现报告如下。

1器材

引物均由宝生物公司合成，Bst DNA聚合酶购自

基金项目：国家质检总局科技计划项目（2008IK176）

作者单位：深圳出入境检验检疫局，广东，深圳518067

·论著·

MBI公司，甜菜碱购自Sigma公司，PCR用水为三蒸水，Taq酶（Takara Taq）、10×PCR Buffer（500mM KCl，100mM Tris，15mM MgCl2）购自宝生物公司，MgCl2（25mM）、dNTP（25mM）购自上海生工。

胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit），T-A克隆试剂盒购自Promega公司；JM109大肠杆菌由本室保存；培养基购自北京陆桥。

2方法

2.1引物序列

引物序列见表1。

2.2菌株的培养

创伤弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌用碱胨水（含3%NaCl）培养及2216E平板培养，其它细菌一般用营养肉汤增菌。

2.3DNA的提取

取1mL菌液，12000rpm离心2min，弃上清，加入100μL水悬浮沉淀，100℃10min，冷却至室温，12000rpm离心8min，离心取上清作为PCR扩增的模板。

2.4LAMP检测方法的建立

分别优化引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、甜菜碱浓度、反应温度、反应时间建立LAMP检测体系。所建立的25μL E.coli O157:H7LAMP检测体系为：1×buffer，内引物2.4μM，外引物0.4μM，Mg2+10mM，dNTPs1.0mM，甜菜碱1.2M，Bst DNA聚合酶8U，DNA2μL；反应条件为63℃，90min；0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物。

2.4.1阳性对照：25μL反应体系：1×buffer，dNTP各200μM，引物各60pM，Taq酶0.5U，Mg2+1.5mM，DNA 2μL。反应条件：94℃3min；94℃15s，55℃40s，72℃45s，35个循环。用Tamara PCR产物纯化试剂盒纯化产物。用Promega TA克隆试剂盒将纯化后的目的片段克隆到载体上。转化JM109大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行PCR鉴定。将PCR扩增结果为阳性的克隆进一步培

养，提取质粒，将质粒稀释成105拷贝/mL，用E.coli O157: H7LAMP检测体系进行检测。

2.4.2阴性对照：以无DNA污染的超纯水为阴性对照。

2.5 E.coli O157:H7LAMP检测方法的特异性检测

对9属13种41株菌进行检测。

2.6 E.coli O157:H7LAMP检测方法的灵敏性检测2.6.1检测生理盐水稀释液的灵敏性：将纯培养的E. coli O157:H7标准菌株制成0.5麦氏单位的菌液，将此菌液用生理盐水10倍稀释至100CFU/mL，分别取103CFU/mL和104CFU/mL梯度的100μL菌液各涂布两个营养琼脂平板，37℃培养过夜后进行平板计数，推算原菌液的准确浓度。同步取原108CFU/mL菌悬液1mL通过水煮法制备模板，模板用超纯水10倍梯度稀释，用所建立的E.coli O157:H7LAMP检测体系进行检测。每个稀释梯度设三个平行管，DNA模板加样量为5μL/管，超纯水体积相应改变，其余成分不变。2.6.2检测人工污染样品的灵敏性：取经国标法（GB/T4789.36-2008食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7NM检验）预检E.coli O157:H7阴性的鸡肉10g，加入到90mL EC肉汤，于组织捣碎机中匀浆约60s，制成鸡肉匀浆。取9mL鸡肉匀浆接入1mL已知浓度的标准菌株，混匀作为食品样品原样，之后以鸡肉匀浆为稀释液10倍倍比稀释原样至100CFU/mL，各取1mL用水煮法提取DNA，进行LAMP检测，平行检测8次。

2.7应用实验

分别用本项目建立的LAMP法和国标法（GB/T 4789.36-2008）检测76份样本（为我单位日常检测中的样品，涉及肉、奶、水产品，为O157:H7阴性样品）。取15份样品用E.coli O157:H7标准菌株菌液进行接种，接种浓度0.9×103CFU/500g。将上述76份样品进行增菌，随后分别做LAMP检测和标准法检测。

3结果

3.1阳性标准品的制备

用所建立的LAMP检测体系扩增所制备的阳性质粒，可以扩增出阶梯状条带（见图1）。

3.2 E.coli O157:H7LAMP检测方法的特异性

用E.coli O157:H7LAMP检测方法的特异性检测结果见表2，27株E.coli O157:H7均出现LAMP特有的阶梯状扩增条带，3株大肠杆菌、2株沙门氏菌、1株单增李斯特氏菌、3株志贺氏菌、1株板崎肠杆菌、1株

表1 E.coli O157:H7rfbE基因LAMP引物序列Table1Primers for rfbE detection

名称F3 B3 FIP

BIP

引物

5′-GCATGACGTTATAGGCTACA-3′

5′-TCTCCTTTCCTCTGCGGT-3′

5′-CAGCAATTTCACGTTTTCGTGATATAGGATGAC

AAATATCTGCGC-3′

5′-TCAACAGTCTTGTACAAGTCCACTGAGACCAT

CCAATAAGTGTG-3′