参考教案-紫甘薯花青素提取纯化及鉴定

参考教案：紫甘薯花青素提取、纯化及鉴定
食品都有一定的颜色特征,色泽的好坏直接影着消费者对食品的可接受性以及对其品质的评在食品加工业中常用的食用色素有合成色素和然色素两大类。

合成色素是由人工合成方法所制的有机色素,具有较好的稳定性,着色强度高、经使用方便等优点。

然而,随着医学毒理学和生物究的不断深人,发现曾允许使用的人工合成食用素中,大多数对人体都有不同程度的伤害,有的甚有致畸致癌致突变作用,在使用上逐渐受到限制。

天然食用色素即是源于天然资源的食用色素是从果蔬、动物及矿物质中提取得到或天然存在色素的合成复制品。

如：类胡萝卜素、花青素、醌类色素、藻蓝素等，大多数天然色素对人体无毒无害,具有维生素活性,富含人体所需的营养物质,有些还对人体有医疗保健的作用。

同时,绝大部分的天然色素着色自然,能更好地模仿天然物颜色,并具有特殊的芳香气味,添加到食品中会带来愉快的感觉,更能引起消费者的注意。

因此,研究与开发无毒的天然食用色素已成为食用色素发展的总、趋势。

花青素(Anthocyanidins)属酚类化合物中的类黄酮类，是一种水溶性色素，一般存在于植物花瓣、果实的组织中及茎叶的表面细胞与下表皮层。

其色泽随 pH不同而改变，由此赋予了自然界许多植物明亮而鲜艳的颜色。

在自然状态下，花青素在植物体内常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等形成糖苷，称为花色苷(Anthocyanin )。

现有资料表明花青素有二十余种，在植物中常见的有六种，即天竺葵色素(Pg)、矢车菊色素(Cy)、飞燕草色素(Dp)、芍药色素(Pn)、牵牛花色素(Pt)和锦葵色素(My)。

它是由一定数量的儿茶素、表儿茶素缩合而成的聚合体，其分子结构中由于含有不对称碳原子(2位或 2，3位)，因此具有旋光性。

花青素具有很强的极性，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，但不溶于乙醚、氯仿、苯等。

另外，由于分子中有大量的酚羟基存在，因此具有弱酸性，可溶于碱性水溶液。

原花青素(proanthocyanidins)也是广泛存在于许多植物中的一大类聚多酚类化合物，其结构主要由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，因在一定条件下能分解为花青素而得名。

按其聚合度的大小，可把原花青素分为低聚物(二～四聚体)和高聚物(五聚体以上)两类，其中尤以低聚原花青素(Oligomeric Proanthocyanidins，简称OPCs)的研究较多、作用较肯定。

【*】
【*】张小军，夏春镗等，原花青素的资源及研究进展，2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集，2468-2483
紫色甘薯为旋花科一年生草本植物，具有多种营养、药理和保健功能, 紫甘薯红色素(PSPC, purple sweet potato color)是从紫甘薯的块根和茎叶中浸提出来的一种天然红色素,具有多种营养、药理和保健功能,是一种理想的天然食用色素资源。

紫色甘薯色素的主要成分为氰定酰基葡糖苷和甲基花青素酰基葡糖苷。

研究表明, 紫甘薯红色素具有花青素类色素的一般通性,色调和稳定性易受pH值的影响;酸性时色素稳定,呈红色或紫红色,而碱性时不稳定,呈黄绿色;在酸性介质中色素在可见光区的最大吸收峰为540 nm。

紫甘薯红色素的固态呈紫黑色，其稀酸液为鲜艳透亮的深红色， 1%色素液呈红。

紫甘薯色素结构中所含的多个酚羟基，使它具有亲水性，能溶于水和无水乙醇、甲醇等低级醇类，不溶于石油醚和菜油等。

又因PSPC分子中毗喃环1位上有一四价氧原子，使其紫甘薯色素的制备及生物学活性研究又具有碱的性质，因此PSPC在酸性溶液中极为稳定。

花青素分子式：C15H11O6 ，分子量：287.246，结构如下：
植物中常见的花青素
紫色甘薯花青素的主要成分是矢车菊素和芍药素及极少量的天竺葵色素，以糖苷化后的酰基化衍生物形式存在。

由于酰基化有利于花青素的稳定，紫薯中花色苷比同类天然色素更为稳定。

一、教学目的
通过紫色甘薯色素的提取纯化与鉴定使学生学会生物样品中色素的提取制备方案设计与实践研究，体验从复杂生物体系中提取天然色素的基本原理、操作过程和分析鉴定方法。

整个实验过程学生独立完成，所需要的时间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。

有利于培养学生的学习兴趣。

二、实验方案
1材料与方法
1. 1 实验材料与器皿
1.1.1实验材料与试剂
新鲜紫色甘薯, 柠檬酸（AR）、亚硫酸钠（AR）、标准pH缓冲液；无水乙醇（AR）、AB-8大孔树脂、矢车菊素(Sigma)。

1.1.2实验仪器
超声波细胞破碎仪、数显恒温水浴锅、紫外光光度计、电子天平、旋转蒸发仪、真空干燥箱、固体粉碎机、层析仪等
1. 2 分析方法
目前紫薯花青素的检测方法大都仅是定性分析，主要有色谱法和紫外可见分光光度法。

由于紫甘薯色素成苷化和酰基化的多样性，采用色谱法直接测定需要多种标准品，成本昂贵。

由于花青素核在可见光500nm～550nm具有强烈吸收，并且糖苷化和酰基化对其可见光谱性质的影响不大，使得可见分光光度法成为一种切实可行的检测方法。

可见分光光度法测定花青素目前常用的有色价法和pH示差法等。

可见分光光度法定量分析需要采用合适的标准物质来做出工作曲线，目前常用经验系数、提取液的吸光度或者与花青素可见吸收类似的苋菜红来表示花青素含量的高低。

色价法快速简单，不需要标准品。

控制提取液最大吸收波长处的吸光度介于0.2～0.7之间，再除以称样质量，可作为紫甘薯花青素含量高低的快速定性方法；pH示差法根据不同pH条件下花青素结构及可见光谱的变化测定花青素色素含量。

然而由于生物样品的复杂性，伴生的辅色剂、金属离子等可改变花青素的离解及颜色，难以通过简单的pH调节反应真正的空白。

毛建霏等[1]以矢车菊色素为标准品，使用柠檬酸水溶液超声提取紫薯花青素色素，结合亚硫酸钠漂白，采用可见分光光度法建立了一种紫薯总花青素含量定量检测方法。

矢车菊色素在0～30ug／mL范围内成线性响应，线性相关系数0.999，检测限0.5ug／mL。

[1]毛建霏，可见分光光度法测定紫甘薯总花青素含量，食品与发酵科技[j]，Vo1.4 6，No.2，101-104
1.2.1矢车菊光谱性质及标准曲线绘制[1]
1.2.1.1色素提取
取适量紫薯干粉样品2g左右于250mL锥形瓶，加入100mL 0.1 M柠檬酸水溶液，超声半个小时后过滤。

取澄清滤液进行下一步分析。

1.2.1.2样品光谱性质及测定
使用紫外-可见分光光度计测定，提取色素在200 nm～700nm波长范围内的紫外-可见光
谱性质。

取5 mL 样品液于10 mL试管，用0.1 M柠檬酸水溶液稀释至10 mL。

对照空白试管取相同量样品液，在定容前加入0.5 m L 10 ％Na2SO3溶液。

加塞混匀，静置5 min后分别于1cm的比色皿中，用分光光度计在波长518 nm处测定其吸光度A，样品稀释液扣除空白为
测定值。

1.2.1.3用紫外-可见分光光度计测定矢车菊素
在200nm～700nm波长范围内的紫外可见光谱性质。

在弱光下精确称取1.35 mg 矢车菊标准样品，转移至25 mL容量瓶中，烧杯用10 mL 0.1 M柠檬酸水溶液洗涤三次，洗涤液转移至容量瓶中，然后用0.1M柠檬酸水溶液定容，即为54ug／mL的矢车菊标准溶液。

分别移取5mL、2mL、lmL、0.5 mL、0 mL矢车菊标准溶液于10mL比色管，并用柠檬酸缓冲溶液定容至10mL，即配制成27ug／mL、10.8ug／mL、5.40 ug／mL、2.70ug／mL、0ug／mL的矢车菊标准溶液。

空白溶液在定容前加入0.5 mL10％亚硫酸钠溶液。

在最大吸收波长下检测吸光度，并绘制标准曲线。

1.2.2苋菜红标准曲线的绘制
精密称取干燥至恒重的苋菜红0.0199g，用蒸馏水定容至100mL。

精确移取0.4、0.6、1.0、1.4、1.8mL该溶液于10mL的容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，525nm下比色测定吸光度。

将所得数据进行回归处理，建立标准曲线，得回归直线方程。

2.紫甘薯色素的提取工艺
花青素是植物的次生代谢产物，存在于植物细胞的液泡之中。

因此，在提取过程中辅以细胞破裂技术来加速植物细胞壁破裂，使内含物迅速渗透扩散，从而提高色素提取的效率。

2.1主要流程图：
2.2 实验步骤
2.2.1原料预处理
选用新鲜，无病虫害，无腐烂的紫甘薯，用水洗净，切成5mm左右颗粒，60℃烘干，粉碎，过60目筛，干燥避光保存
2.2.2紫甘薯色素的提取
提取条件：温度为35～60℃，时间为1小时，料液比为1:25，盐酸浓度为0.5%（或0.1 M柠檬酸水溶液），搅拌或超声波辅助提取提取两次。

提取结束后，将色素提取液放入离心机中，在4000r/min下离心，得到色素上清液，待其冷却到室温后，用相应的提取溶剂定容至100ml，提取溶剂作参比，在525nm下，用1cm比色皿测其吸光度值。

紫甘薯色素的得率(mg/g)=CV/M
C—溶液中色素的浓度(µg/ml)；V—样品液的体积100ml；M—紫甘薯粉末的质量(g)
2.2.3紫甘薯色素的纯化
2.2.
3.1大孔树脂的预处理
将AB-8大孔树脂用无水乙醇充分浸泡24小时，赶出空气泡。

浸泡之后，用水冲洗取代乙醇，再用稀NaCl和稀Na2CO3。

溶液冲洗，除去树脂中痕量的防腐剂和残留的单体化合物，最后再用蒸馏水冲洗至无醇味，滤去水分备用。

2.2.
3.2大孔树脂吸附纯化及洗脱
将提取上的色素溶液，上样流速为 2.0mL/min，通过装好的AB-8树脂柱，待色素溶液完全吸附后，用浓度80%乙醇进行解吸，流速 2.0mL/min。

紫甘薯色素得率测量
准确移取0.4ml花青素浓液，定容至10ml，525nm测吸光度。

对照苋菜红标准曲线或矢车菊标准计算出花青素含量。

3.实验结果及分析
3.1苋菜红标准曲线或矢车菊标准曲线：
3.2花青素含量与纯度分析
3.3花青素光谱性质的测定与分析
3.4花青素薄层层析
3..5其他性质研究
4结论与讨论：4.1….；4.2….；4.3….
附：苋菜红（Amaranth）的结构
分子式：C20H11N2Na3O10S3
结构式：
苋菜红的鉴别方法：
（1）本品0.1g溶于100mL水中，呈玫瑰红色溶液。

（2）本品微溶于乙醇，不溶于油脂，具有酸性染料的特性，能使动物纤维着色。

（3）含有0.001g本品的100mL0.02mol/L乙酸铵溶液，其最大吸收波长为520±2nm。

（4）取本品水溶液，做纸上层析，其主色点的Rf值应与标准样品相同。

纸上层析条件：
展开剂：正丁醇：无水乙醇：氨水（1%）=6：2：3 ，温度 20~25℃，试液浓度 0.1g/100mL
试液用量 0.002mL ，展开剂前沿上升限度 150mm。