蛋白质双向电泳简介

样品的溶解

2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶 解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复 合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的 溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可 能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单 个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必 须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖 和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样 品在电泳过程中保持溶解状态。

多糖
– –

盐
– –

离子去污剂


固体杂质

样品中核酸的去除

对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成 复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切 酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质 （SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通 过超速离心来去除复合物。
注意事项

双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽 可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐 离子等干扰物质

胶条水合

首先,要选好IPG干胶条的pH梯度。对一个新样品,最 先使用宽范围、线性pH 3.5~10梯度。但对大多数样 品,这样做可能会降低pH 4~7区域的分辨率,因为许多 蛋白质的pI值分布在该区域。利用非线性的pH 3.5~10 IPG干胶条在一定程度上缓解了这个问题。非 线性pH 3.5~10的胶条在pH4~7区域的梯度比pH 7~10更为平坦,保证在大部分碱性蛋白质都能得到分 辨的前提下,pH 4~7区域能得到更好的分离。若用 pH4 ~7的IPG胶条则能在该范围得到更好的分离效果。 等电聚焦在样品裂解液中运行。IPG干胶条使用前必 须在样品溶液中水合。水合期间,蛋白样品进入IPG胶 条,并分布于整个聚焦介质中,该技术实用且易操作。 此外,要注意在胶条水合开始时在胶背上应覆盖矿物油, 以防止胶条水合或随后的IEF过程中水分散失。
蛋白质双向电泳
简介

双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、 快速、高分辨率和重复性等优点。1975年,意大利生 化学家O.Farrell发明了双向电泳技术,大大提高了蛋白 质分离的分辨率而得以广泛应用,至今已经历了快四十 年的发展,双向电泳技术已较为成熟,但在基本技术上 仍未改变。双向电泳技术包括蛋白样品制备、干胶条 水合、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS-PAGE 电泳等步骤。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分 子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群 的技术

通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂 的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可 用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基 质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂 尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以 打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型 或两性去污剂以破坏疏水交互作用。

待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度

复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能 完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。 预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长

IPG胶条的pH范围

等电聚焦

胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂 可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自 由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦 （TBP）进行还原。
蛋白质组学（proteomics）

概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变 化的一门科学 研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、 修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最 终确定它们的功能

仪器设备
原理

双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大 小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质 群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理 化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质 的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷 的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子 量的不同将之分离。



样品制备 胶条水合 等电聚焦 聚焦后胶条平衡 第二相SDS-PAGE 分离蛋白质的检测与匹配分析
样品的制备

取材时应避免因细胞死亡而引起蛋白降解,尽 可能快速将材料投入液氮中保存。研磨时,组 织样品须在液氮中冷冻,充分研磨成细粉,然后 快速加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,充分混匀。 对于大多数植物样品制备而言,在液氮磨碎的 样品中应快速加入蛋白沉淀剂(如丙酮),并在低 温下沉淀(-20oC)和离心(4oC)。
要用到的试剂







样品裂解液: 7mol/L尿素,4% CHAPS,10mmol/LTris,2mol/L硫脲。 IPG溶胀液: 8mol/L尿素,2%CHAPS,分装成0.5ml/管,-20oC保存。 使用前2.5ml IPG溶胀液加入7mg DTT,0.5%IPG缓冲液(3~10L),少 量溴酚蓝。 平衡液: 50mmol/LTris-HCl (pH8.8),6 mol/L尿素,30%甘油,2% SDS,少量溴酚蓝。使用前10ml平衡液加入0.1mgDTT。 溴酚蓝溶液 :1%溴酚蓝,50mmol/LTris-HCl,分装成0.5ml/管,-20oC 保存。 30%丙烯酰胺贮存液: 30%丙烯酰胺,0.8%甲叉双丙烯酰胺,0.45um 微孔滤膜过滤后,避光贮存于棕色瓶中4度保存。 凝胶缓冲液储存液： 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8),0.45um微孔滤膜 过滤后,4度保存。 SDS电泳缓冲液 :25mmol/L Tris-HCl (pH8.3),192mmol/L甘氨 酸,0.1%SDS

IPG干胶pH梯度是通过缓冲复合物与聚丙烯酰胺凝胶 共价结合形成的,随着凝胶聚合而将pH梯度固定。即 使胶条在高电压下进行较长时间的等电聚焦,仍保持稳 定的pH梯度。这是高分辨分离所必需的。IPG胶灌注 在塑料片上,然后盖上相同大小的塑料片,机械切割成 固定大小而易操作的干胶条。第二向电泳分离的重现 性有明显提高,主要是因为使用了预制的SDS-PAGE 胶和灌制多板胶的设备,实现了实验系统的标准化,便 于实验室内部及实验室之间数据比较和合作。
第一向：等点聚焦
1. 放置电极垫 (?)
电极垫
2. 200 V
3. 500 V
维持
维持
1.5h
支架盖
1.5h 1500vh
IPG 胶条 电极
4. 1000 V 梯度上升
来自百度文库
5. 8000 V 梯度上升
36000vh
电压
时间
注意事项


通过高压使得蛋白质按照其等电点特性进行 聚焦 胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过 长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生 水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需 要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围 和胶条长度来确定。

根据胶条长度不同,所需的伏特小时数不同,一般随着 胶条加长而增加。伏特小时数范围从7cm胶条的10 kV到24cm胶条的60 kV以上。最佳聚焦时间即IEF分 离达到稳定态所需时间,是获得最好图谱质量和重复性 的基础。若聚焦时间太短,会导致水平和垂直条纹。但 是过度聚焦会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶 表面渗出(电渗),引起蛋白图谱变形,以及在胶条碱性端 产生水平条纹和蛋白质的丢失。因此,最佳聚焦时间必 须根据不同蛋白质样品、蛋白质上样量和所用特定pH 范围及胶条长度来确定。聚焦完成后,胶条既可以在中 间电压500~1000 V下短时间保持,便于随时进行第二 向的平衡,也可以置于-80oC冰箱中进行长期保存。

在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白 质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解 性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质 变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基 因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰 双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂 类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导 致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制 备的药剂必须与等电聚焦兼容。
管状胶条的制备 :

去离子水2.1ml 30%丙烯酰胺 0.8ml 两性电解质 280ul 尿素3.15g,水浴使 尿素溶解。 20%NP- 40 0.3ml 10%过硫酸铵20ul TEMED 2.5ul 摇匀后水平注入内径为 1mm 的玻璃管内, 上端留有 一定空间静置待凝, 每次可灌6—8 根。

SDS-PAGE均一胶各成分用量
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
大 SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
分子量 提取的总蛋 白溶液 小 通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同 位置从而实现蛋白质的双向分离
步骤
IPG 胶的水合及上样
2-DE 样品 水合溶液
水合溶液：
8M 2% 2% 0.28% 微量 尿素 NP-40 或 CHAPS IPG缓冲液 (两亲性电解液) DTT 溴酚蓝
IPG 胶条支架
IPG 胶条 定位
水合目的：使样品能完全以可溶形式进入 IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：

第一步是将IEF胶在375 mmol/L Tris-HClpH8.8缓冲液 (含2%SDS、1% DTT或TBP、6mol/L尿素和30%甘油) 中浸泡10~15 min,尿素和甘油是用于减缓电渗效应,提高 蛋白质从第一向到第二向的转移率。第二步是用5% 碘 乙酰胺替代还原剂DTT的375 mmol/LTris-HCl pH8.8缓 冲液,其他组分及相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化 巯基变成羟乙酰半胱氨酸残基,以便巯基不能重组形成 二硫键。此外,碘乙酰胺还可以烷基化IEF胶内的自由 DTT,否则自由DTT在第二向SDS-PAGE胶迁移,会产生 点条纹的假象。为减少酰氨基组的烷基化,最好在pH 8~9之间进行还原和烷基化。
杂质的除去

脂质
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使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI 丙酮沉淀
阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮 如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100， NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25% 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 过滤
胶条平衡

在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡 IEF胶。主要目的是用含有SDS的第二向介 质置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白 质与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈 还原状态,避免发生重氧化,确保在SDSPAGE过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在 IEF胶内处于其等电点处,净电荷为零,若未 进行平衡过程而直接进入第二向的SDSPAGE分离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在 第二向凝胶中正常迁移。胶条平衡包括两 个简短的步骤,每步10~15 min。