荧光光谱法

荧光光谱法
一、荧光基础理论 二、荧光分析法的测定及其特点 三、荧光分析法在环境监测中的应用 四、荧光分析法今后的研究方向 五、荧光分析法的未来展望
1
一、荧光基础理论
➢1.1什么是荧光 ？
当紫外或可见光照射到某些物质上时，这 些物质就会发射出波长和强度各不相同的 光线，停止照射光照射时，这种光线马上 或逐渐消失，这就是荧光。（最常见的日光灯管
河水
28
井水、河水 29
甲醛
缩合反应 12-192 ng/mL 0.3 ng/mL
苯
电解作用
五种芳香类 光化学反应 杀虫剂
总醛含量 缩合反应
4.7µmol/L- 2.8µmol/L 0.96m mol/L
0.1-20 ng/mL—— 0.11-15.7µg/ mL
0.02-22 ng/mL
100-1000×10- 30×10-9 9
8
12
16
20
Al含量（ug/L)
22
3.4仪器实验条件的选择
荧 光 强 度(INT)
荧 光 强 度(INT)
25 （a)
20
15
10
5
0 4 567 89
pH
30
(b)
25
20
15
10
5
0 1 1.5 2 2.5 3 3.5
8-羟基喹啉用量(mL)
23
荧光强度(INT)
荧光强度(INT)
30
(c)
➢ 土壤、水系沉积物 及固态污染物监测： 硼、 锌；石油烃、苯并芘等。
30
四、荧光分析法今后的研究方向
➢ (1)发展多种有效的样品收集技术，并使 之与荧光分析法相结合，将为荧光分析 法在环境污染物分析方面开辟更广泛的 应用前景。
➢ (2)研究开发更多的荧光试剂，使荧光分 析能测定更多的环境污染物。
检测器
扇形镜 正面图
透明部分 反光镜
双光束型可以消除光源强度变化的影响.
44
3. 其他类型分光光度计
多通道仪器（Multichannel Instruments） 光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管)
photodiode arrays (PDAs)
同时测量200～820nm范围内的整个光谱, 比单个 检测器快316倍,信噪比增加3161/2 倍.
39
光电倍增管(Photomultiplier Tube, PMT)
160-700 nm
1个光子可产生106～107个电子
40
吸光光度法仪器主要差异比较
可见光
（380～ 780nm）
紫外光 （200～ 380nm)
中红外
（2.5～ 50 m )
光源
钨灯 碘钨灯 320～2500
氢灯 氘灯 180～375
表2.间接荧光法测定环境有机污染物
待测物
反应类型 线形范围
检出限
样品
甲醛
缩合反应 5-100×10-9 2×10-9
室内空气
含硫除草剂 光化学反应 14-2912 ng/mL 0.2-6 ng/mL 河水
文献 25 27
甲醛
缩合反应
甲基对硫磷 降解反应
3-600µg/ L 0-2.6µg/ L
0.6µg/ L 5.2µg/ L
其荧光强度 不同 ——定量分析的基础
7
1.1激发光谱和荧光发射光谱
激发光谱：固定荧光发射波长和狭缝宽度扫描， 得到荧光激发波长和相应荧光强度关系的曲线 即荧光激发光谱。
发射光谱：固定荧光激发波长和狭缝宽度扫描， 得到荧光发射波长和相应荧光强度关系的曲线 即荧光发射光谱。
• （由于在测定过程中仪器及其构件等因素的影响，同一物质的 荧光激发光谱和荧光发射光谱均有不同程度的差别）
8
1.2荧光强度与物质浓度的关系：
• 荧光强度：在一定条件下仪器所测得荧 光物质发射荧光大小的一种量度。
F=2.3ΦFI0εbc
其中c为物质浓度。
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在荧光物质浓度较小的情况下，产生的 荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比。 当浓度增大到一定程度，荧光强度常随 浓度的增加而下降。因此荧光分析法用 于微量与痕量组分的测定，而不适于常 量和大量组分的分析。
空气 38
甲醛
缩合反应 0.0136-13.62µmol/L 6nmol/L
空气 42
对硝基苯酚 降解反应 10-200 ng/mL
敌敌畏
偶联反应 0-1.0 mg/L
3ng/mL 0.022 mg/L
水及废 43 水
水样 45
久效磷
降解反应 0-3.2µg/ mL
氯苯氧基类 光化学反应 0.1-4.5µg/ mL 除草剂
壁上涂的荧光粉就是吸收紫外线而发射出可见光，因此日光灯又称 荧光灯。）
2
光学光谱区
远紫外 近紫外 可见光 近红外 中红外
（真空紫外）
10nm~200nm 200nm 380nm 780 nm ~380nm ~ 780nm ~ 2.5 m
2.5 m ~ 50 m
远红外
50 m ~300 m
3
➢1.2荧光的发现及发展
乙醇或天然水 30
水样
31
水样
33
汽车尾气 27 34
待测物
反应类型
表2.续
线形范围
氯苯类除草 光化学反应 0.5-2.5µg/ mL 剂
多环芳烃 光化学反应 1-20µg/ mL
检出限 23-98 ng/mL
样品 水样
文献 36
0.05µg/ mL 土壤 37
甲醛
缩合反应 2-100×10-9
0.2×10-9
31
➢ (3)发展新的荧光技术和试剂，解决环境 监测中的难点问题
➢ (4)荧光分析法与其他分析方法的联用是 今后研究的一个热点方向。
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五、荧光分析法的未来展望
中国在目前阶段属于发展中国家，正在准 备在短的时期内成为发达国家。对经济， 对自然环境压力很大。如使用荧光分析 方法，一方面可以有效的节省环境检测的 开支，另一方面可以得到关于污染的正确 信息。因此，对中国，对全世界的稳定发 展和繁荣意义重大。
分子中具有不同的能级，电子处于不同的能级 中。通常情况下分子的电子处于最低的能级状 态，即基态用S0表示。当光照射到分子上，电 子被激发，从低能级跃迁到高能级即激发态， 用S1, S2……表示。高能级的电子不稳定，通 过辐射跃迁和非辐射跃迁失去能量返回基态， 而荧光就是激发态的分子和原子返回基态过程 中放射出来的一种光能。若被光照射激发的是 分子，发出的是分子荧光。如图1所示。
16
光源发出的光经第一单色器〔激发光单色 器)，得到所需要的强度为I0激发光波长， 通过液池．部分光线被荧光物质吸收，荧 光物质被激发后，向四面八方发射荧光， 为了消除入射光及杂散光的影响，荧光的 测量在与激发光成直角的方向。经过第二 单色器(荧光单色器)，将所需要的荧光与 可能共存的其他干扰光分开。荧光照在检 测器上，光讯号变成电讯号，经放大，记 录仪记录。
4.0µg/ L
水样 46
23-98 ng/mL 水样 28 36
➢2.水中石油的测定
—分子荧光方法:检出限为0.001mg/L，正己烷
萃取,无污染等
—红外测 油法：检出限为几到几十mg/L，四
氯化碳萃取污染严重等
29
3.环境中无机污染物的测定
➢ 水质监测：天然水、饮用水、污水中的铝、硼、 钴、铜、铁、锰、钼、镍、铅、锡、铀(2)、钒、 锌；氰化物、硝酸盐态氮、亚硝酸盐态氮、硫 化物、 等。饮用水中的砷、硼、铍、铬(2)、 铁、硒、硅、氟化物。
5
S2 紫外
单重态
三重态 T2
S1
可见
振 v3
Ee 红外
S0
动 能 级
v2 v1
Ev 转动 rrr213
荧光
Er
磷光 T1
图1.分子吸光与发光示意图
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二、荧光分析法的测定及其特点
➢1.分子荧光分析法： ✓不同物质激发光谱和荧光发射光谱不同
——定性分析的基础 ✓同一物质，其它条件相同0-2.0mg/L
挥发酚
不明确
1-萘酚
5.0×10-7-1.0×105mol/L
2-萘酚
1.0×10-7-1.0×105mol/L
酚类化合物 （19种酚）
1-60µg/ L，2100µg/ L，4-200µg/ L，100-1000µg/ L，
20-500µg/ L
挥发酚类化合 物
—线性范围宽: 0.005mg/L-50mg/L
—分析成本低 —设备简单，操作简单快速，计算机进行仪器控
制和数据处理 —提供激发光谱、发射光谱等许多信息
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3.测定实例
3.1荧光分光光度计
F95-96荧光分光光度计
13
F-4500荧光分光光度计
14
F02-3M荧光分光光度计
15
结构：组成有光源、单色器(滤光片或光栅)、液 池和检测器。光学系统示意图见图2.
不明确
苯酚
0-0.5 mg/L
检出限 4.3µg/ L
2µg/ L 2.0×10-7mol/L 1.0×10-7mol/L
0.3-17µg/ L
不明确 5.1µg/ L
样品 环境水样
天然水 合成样
文献 14 15 16
水和废水 18
造纸厂废水 19
水
20
十二烷基苯磺 酸钠
不明确
4.0ng/mL
饮用水、污 26 22 水
荧光现象早在16世纪就被发现，但对荧 光产生的原理和条件直到19世纪才清楚。 Stokes在1852年详细考察了奎宁和叶绿素 的荧光后发现，他们的荧光波长比照射光 波长要长，认定是物质吸收光后重新发射 出的光，并且波长不同，荧光是发射光被 证实。根据“荧石”能发出这种光，提出 了“荧光”的概念。
4
➢1.3荧光产生的原理
20
3.2扫描激发光谱图和发射光谱图
8一羟基喹啉—A1荧光光谱图
1-1(EM) 200
100
0 300
400
500
600
700
800
nm 900
（注：ex-365nm（紫外）,em-512<300-800>）
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3.3测标样绘制标准曲线
荧光强度
60 50 40 30 20 10 0
4
y = 10.561x - 0.037 R2 = 0.9998
低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录
37
硒光电池（Barrier-layer photocell）
h
阴极Au，Ag
半导体 Se
阳极
适用于300-800 nm, 在500-600 nm范围最灵敏。38
光电管(Phototube)
h
（片） 红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm
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1.光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足
够 的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm) 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源
强度
氙灯（气体放电光源）
氢灯
钨灯（热辐射光源）
400 600 800 1000
/nm
18
氙灯
氢灯
钨灯
19
2.滤光片和分光器 滤光片为单色器时，干涉滤光片性能最 好，精密的荧光光度计均用分光器作单 色器。 3.检测器 简单的荧光计用目视或硒光电池作检测器。 精密的荧光光度计则采用光电倍增管。
25
20
15
10
5
0 0 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
缓冲溶液用量（mL)
30
(d)
25
20
15
10
5
0 0123456
萃取次数
24
三、荧光分析法在环境监测中的 应用
➢ 1. 有机污染物的测定： —直接荧光法测定环境有机污染物见表1。 —间接荧光法测定环境有机污染物见表2。
25
表1.直接法测定环境中的有机污染物
33
谢谢！
34
单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同. 玻璃350～3200nm, 石英185～4000 nm
白光 入射狭缝 准直透镜
棱镜
λ1
λ2
聚焦透镜 出射狭缝
800 600 500
400
35
光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等 间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。
硅碳棒 （红外线）
吸收池 玻璃
石英
材料 （350～3200）（185～4000）
NaCl晶体
42
8.2.2 分光光度计的基本类型 1. 单光束分光光度计
可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图
43
2. 双光束分光光度计
反光镜
光源 hv 滤光片或 单色器
参比池
栅镜 样品池 扇形镜
放大器 光子检测器 反光镜
－平面透射光栅
平面透
－反射光栅（广泛使用） 射光栅
透 镜
光屏
M1
波长范围宽, 色散均匀,
分辨性能好, 使用方便. M2
出
光栅衍射示意图
射
狭
缝 36
吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。
可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池
检测器：利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。
光电池，光电管，光电倍增管
检流计（指示器）：
10
1.3荧光分析法的测定
➢直接测定法 ：通过测定被分析物（本身 具有荧光）的荧光强度来确定其浓度。 （使用受限制）
➢间接测定法 ：通过化学反应使无荧光的 物质转变成适合测定的荧光物质 （应用更广泛）
11
2.荧光分析法特点：
—灵敏度高 ：比紫外-可见分光光度法灵敏度高
2-3个数量级，比原子吸收分光光度法 高103 ～104 倍，检测限可达ng／mL