巴氏染色的操作方法

巴氏染色的操作方法

染色有4个步骤：1、固定；2、核染色；3、胞浆染色；4、透明。

主要达到以下要求：1、核的结构清晰；2、透明度高；3、分色恰当。

一、固定

1、固定的目的

细胞制片的迅速固定是制片过程中关键的一步，否则会影响细胞学诊断的准确性。对于不同的标本需要不同的固定方法。最为常用的固定方法是95％酒精作为固定液的湿固定法。酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内的酶将蛋白质分解而自容，并凝固细胞内的物质如蛋白质、脂肪和糖类等，使其保持与组织生活相仿的成分，从而使细胞各部分，尤其核染色质易于着色。对于巴氏染色来说，酒精固定最为重要的。如果酒精浓度不足引起的固定不佳，可造成细胞的人为变化，并可导致假阳性或假阴性的诊断。

2、固定方法

湿固定法：作为用95％酒精固定液固定的细胞学标本一定使用湿固定法。制片制备完后，趁标本新鲜而又湿润时，立即放入盛有95％酒精的固定缸内。制片在固定液内至少保持15-30min。固定时间通常不超过1周。这种制片染色后，颜色鲜艳，结构清晰。

如果细胞制片需要送至另一实验室或邮寄他处染色时，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因为无论固定前或固定后的制片，如果发生干燥后都会影响染色的效果。

3、固定注意事项

固定液的过滤：为了防止细胞污染，凡是使用过的固定液，必须过滤后才能再使用。使用过长的固定液，必须用酒精相对密度计测定，酒精浓度低于90％时应该及时更换新液。

湿固定的重要性：标本再新鲜时及时固定时保证染色效果的重要因素。如苏木素对细胞核的染色，巴氏染色中胞浆的特殊着色作用，均可因标本干燥后固定而大受影响。

制片标本的邮寄：标本再固定15min后取出，立即加甘油数滴于制片上，装入密封的小盒中。实验室在收到标本后，先浸入95％酒精中，使甘油溶去，再进行染色。

二、核染色

1、苏木素液浸染时间一般在3-5min，但是必须随气温和染料情况而酌情改变。夏季或放置较久的苏木素染液容易着色，时间要缩短；冬季或新配制的苏木素染液和应用已久较稀释的苏木素液不易着色，时间要延长。在使用苏木素染色时，一般有2种方法：1）过染法：首先有意识地进行深染，然后通过盐酸酸化过程使核染色趋于合适。这种方法能够在酸化过程中把胞浆内黏附多余的苏木素染料去掉，使胞浆染色更为鲜艳、清晰、多用于黏液多的标本。2）淡染法：在核染色过程中，严格掌握染色时间，使核染色适宜而不用盐酸酸化，但是胞浆中少量的苏木素会影响EA染色的质量。主要用于黏液少的标本，避免在酸化和自来水冲洗的过程中使细胞成片地脱落。

在使用苏木素染色时，一定要每日进行过滤，否则苏木素结晶会影响染色的质量。一般苏木素染液可以使用较长时间，所以每日增加少量新鲜染液即可。

2、碱化碱化亦称返蓝过程，可以使用饱和碳酸锂或3％氨水碱化，目的使苏木素及早显色，时间约数秒。更重要的是流水冲洗，可使蓝色显的更鲜艳。碱性溶液亦需要充分漂清才不会妨碍下一步的胞浆着色及标本制成后的颜色保存。分化和碱化溶液至少每天更换新液。

三、胞浆染色胞浆染色在巴氏方法中亦称为OG—EA染色，它包括橘黄G（OG）和EA两部分染色。由于橘黄G是一种小分子染料，能够很快地作用于胞浆，一般染色时间不宜过长，通常1-2min。对于宫颈、阴道上皮中非正常角化细胞和角化型鳞癌细胞的胞浆中都可以出现鲜艳的橘黄色。

四、封固制片封固制片对于避免空气干燥的影响，制片经长期存放不褪色是非常重要的。一般使用

24mm×50mm或24mm×60mm的盖玻片，用二甲苯调配的中性树胶进行封固。

五、透明染色的最后一步是透明，使细胞的色度与细胞的重叠不致影响镜下检查。这是在脱水与制片封固之间的一项重要步骤。最常用的透明溶剂使二甲苯，二甲苯的折射率在1.494，载玻片的折射率在1.515，两者较为匹配。如果二甲苯溶液出现颜色或变得浑浊，一定要更换新液。

巴氏染色操作流程

95％乙醇固定（15min）→清水冲洗多次→苏木素染液（3-5min）→清水冲洗三次→蓝化→95％乙醇漂洗→橙黄染液（1-10s）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→100%乙醇漂洗→EA50（3-5m）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→无水乙醇漂洗→无水乙醇（2min）→二甲苯（2min）→中性树胶封片

染色注意事项

1、细胞核着色不佳：

（1）细胞核着色过浅：

1）盐酸分化时间过长或苏木素染液时间过长。需要缩短分化时间或延长碱化时间；每日加入少量新鲜苏木素染液或重新配制苏木素液。

2）在固定之前制片干燥。所以对巴氏染色的制片需要严格遵守湿固定的原则。

3）自来水的PH值偏酸性。使用碱性溶液。

（2）细胞核着色过深：

1）盐酸溶液浓度不够。适当加入几滴盐酸以增加浓度。

2）制片用高于95％以上浓度的酒精固定后可以出现染色过深。应用95％酒精固定。

2、细胞浆着色不佳：

（1）如果全片内胞浆都淡染，则需要延长染色时间或更换新液。

（2）如果胞浆不分色，均为浅红色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌样细菌影响胞浆染色。此情况可以适当增加染色时间能够部分纠正不分色状况。

（3）胞浆染成灰色或紫色，是由于苏木素染色时间过长或盐酸分化不佳。经过褪色后重新苏木素可以纠正。（4）由于标本的不同，同样配方的EA染液可造成偏蓝、偏绿和偏红，对不同的标本应该使用不同的EA 染液。一般认为，EA36和EA50用于妇科标本，而EA65或改良EA用于非妇科标本。

（5）胞浆不分色的另一重要原因是由于EA染液的PH值不恰当所致。如染色为红色，可以加少许磷钨酸溶液纠正；如染色均为蓝色或绿色，可以加少许饱和碳酸锂溶液纠正。对于改良EA染液，每100ml染液加入2ml冰醋酸后染色效果更佳；染液使用更持久。

TCT的具体操作步骤：

1. 使用TCT专门的宫颈刷来采集子宫颈细胞样本，需要深入宫颈，采集到移行带的宫颈脱落细胞。

2. 将已经刷取下脱落细胞的宫颈刷放入装有细胞保存液的小瓶中进

行漂洗，使细胞转移到保存液瓶中。

3. 将保存液瓶放入全自动细胞制备将样本细胞通过混匀、过滤、转移，最后贴附到玻片上。

4. 将玻片进行染色制片固定，最后在显微镜下进行观察诊断。

TCT在宫颈疾病诊断中的优点

其实TCT检测只是宫颈病变检查的第一步，一般说来，宫颈病变的诊断分为三步：TCT、阴道镜和病理学诊断。她说，尽管细胞组织是否属于病变只有病理学诊断才真正具有权威性，但TCT的第一道关卡仍然显示出了明显的优势。如果TCT显示有问题，那么女性就应该进一步做阴道镜或病理诊断才能准确判断病情；但如果TCT 的检查结果显示为良性，这些检查则可以不用再做了，女性也可以为身体健康松一口气，不过仍要注意定期复查。所以说，TCT 能够起到了事半功倍的效果。

TVC三阶梯诊断技术，可早期诊断宫颈癌

第一阶梯：TCT薄层液基细胞学检测

首先采用目前较先进的薄层液基细胞学技术(TCT)，在显微镜下观测宫颈细胞，查看宫颈细胞是否有异常。因为宫颈癌变最早是从宫颈细胞的异变开始的。另外，如果经济条件允许的话，也可以进行HPV检测，这样准确度会更高些。

第二阶梯：电子阴道镜检查

经过TCT薄层液基细胞学检测后，如果发现宫颈细胞有异常，则

好发区表层的细微变化，对于宫颈癌及癌前病变的早期发现、早期诊断具有重要价值。

第三阶梯：组织病理学检测

如果阴道镜检查中发现异常应在特殊染色指导下取活检。在阴道镜检。提示下，对可疑病变部位多点活检，分别进行组织病理学检查，可确诊宫颈病变

经过以上三个阶梯的检查，就可以确定宫颈病变，发现宫颈癌早期，防患于未然。