热休克蛋白与免疫应答

收稿日期:1999-10-20;修订日期:2000-12-30基金项目: 国家自然科学研究基金资助(39770824)
作者简介:范云霞(1964-),女(汉族),河南平顶山市,中国协和医科大学生物化学硕士研究生审校者:中国协和医科大学肿瘤研究所 黄常志
026 热休克蛋白与免疫应答
范云霞
(中国协和医科大学肿瘤研究所,北京 100021))
摘要:近年研究发现,热休克蛋白参与免疫应答过程,在抗原受体成熟、抗原加工、呈递等多方面起作用,并且这种作用具有潜在的临床应用前景,本文综述这一领域的研究现状。

关键词:热休克蛋白;免疫应答;抗原受体;抗原加工呈递
文章编号:1001-103X(2001)02-0062-03 中图分类-号:R392 11 文献标识码:A 热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)是一组具有重要生理功能,高度保守的蛋白质分子家族。

生理、病理及环境因素等都可诱导热休克蛋白产生,故又称为应激蛋白(Stress Protein)。

根据分子量大小和同源程度可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP 及泛素等几个家族。

热休克蛋白的生物学功能广泛,不仅表现在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象,保护细胞生命活动,以确保细胞生存,而且在蛋白质折叠、跨膜运输、转位、细胞骨架及核骨架稳定等基本功能方面发挥重要作用,调节这些蛋白的活性和功能。

而自身并不参与大分子蛋白组成,故称为 分子伴侣 。

本文主要综述HSP70、HSP90、泛素等在抗原受体装配、抗原加工与呈递等方面的作用。

1 HSP70、HSP90、泛素组成和结构
HSP70家族成员广泛存在细胞的各个亚细胞结构、胞浆及胞核中,如:组成性表达HSC70(Heat Shock Cognate Protein,HSC70),热诱导表达HSP70,定位于内体和质膜PBP72/74(Peptide Binding Protein,PBP),线粒体基质中GRP75(Glucose Regulated Protein,GRP),内质网腔丰富存在BiP(Immunoglobulin hea vy chain binding Protein,BiP)。

HSP 家族N 端结构域高度保守,具有ATP 酶活性,类似肌动蛋白ATP 酶结构域。

HSP70C 端结构域是多肽和蛋白结合的部位,同源性差异大,其C 端空间结构类似于MHC(Major Histocompatibillity Comple x ,MHC)结合抗原肽的结构域。

HSP70家族具有翻译后磷酸化修饰,大多在Ser/Thr 位点,个别在Tyr 位点(GRP75),结合ATP 后
空间构象改变促使其与结合蛋白解离,HSP70/ADP 对底物具有更高亲和力,有助于HSP70/蛋白复合体稳定 1,2 。

HSP90家族常见有HSP90、gp96(GRP94)等。

gp96存在于内质网腔,gp96N 端具有跨膜序列,故可在细胞膜上表达,其C 端有内质网腔定位序列(KDEL)。

HSP90存在于胞浆,其N 端结构域是结合底物蛋白结构域,类似蛋白酶结合底物口袋,C 端为寡聚化结构域,HSP90含有两个高极性氨基酸区,这些极性氨基酸残基可能位于蛋白表面,参与其它蛋白的相互作用 3,4,20 。

泛素(Ubiquitin,Ub)广泛分布在胞浆及胞核中小分子蛋白,富含半胱氨酸和赖氨酸,其空间结构中有一疏水性内核,具有锌指结构,可能有结合DNA 功能,泛素通过其羧基端的甘氨酸与异常蛋白和短寿蛋白的赖氨酸残基的侧链氨基以异肽键方式共价结合,介导蛋白的降解
5。

2 热休克蛋白与抗原受体的相互作用
免疫应答过程中,抗原受体包括免疫球蛋白I g,膜表面Ig,MHC 类分子,MHC 类分子,TCR/CD3复合受体。

细胞表面有功能抗原受体产生是免疫应
答的物质基础,热休克蛋白参与抗原受体肽链的折叠促进正确装配,阻止无功能中间体聚集,促进错误折叠的抗原受体的降解,保证有功能抗原受体生成。

2 1 Ig
I g 单体由轻链(Light chain,L)及重链(Heavy chain,H)组成四聚体分子,BiP 与L 链结合部位为V L ,与H 链结合部位主要在C H 1功能区,促进新生轻
重链功能区的正确形成,两者结合受ATP平衡状态及所处离子状态影响,因而与这种结合是短暂和不稳定。

单一BiP分子可循环结合多个Ig亚单位,每一个Ig亚单位可反复结合BiP,BiP对L链早期中间体具有更强结合能力,与BiP的分子伴侣作用是相一致。

突变的L链,甚至单一点突变明显加强与BiP 结合。

对此解释: 与BiP结合多肽的选择性有关。

突变L链与BiP形成更稳定中间体。

突变使L 链与BiP接合部位在L链成熟过程中不能及时隐蔽,造成BiP反复结合。

GRP94仅结合未装配的L 链和H链。

BiP ATPase区域的突变具有显性负调节Ig空间构象的成熟、二硫键的形成以及分泌。

GRP94与I g亚单位结合与BiP不同,GRP94与L链结合需要ATP,而BiP不需要;GRP94更专一地结合较为成熟的完全处于氧化状态L链。

BiP和GRP94表达和B细胞Ig表达水平相平行,尤其是B细胞分化为浆细胞过程中,高水平BiP和GRP94表达可有效地加强Ig装配、转运和分泌 6,7 。

2 2 TC R
TC R以异二聚体( or )形式存在T细胞表面,识别MHC/抗原肽复合物,BiP和单独存在 链相互作用,这种相互作用生理机制不清,由于 链在T细胞发育过程中,总是和 链共表达,单独表达于胞膜上 链呈现不稳定状态,需要进一步阐明BiP 在TCR成熟中作用 8 。

2 3 MHC
MHC 类分子( / 2m)和MHC 类分子( / ),两者呈递抗原肽,BiP参与人的MHC 类分子 重链的折叠,防止 重链降解,促进其构象成熟,促进 重链与 2m结合。

用抗GRP94抗体可免疫共沉淀MHC 类分子,说明GRP94亦参与MHC 类分子成熟。

未完全装配成MHC 类分子的亚单位和BiP 以高分子复合物形式存在。

BiP与MHC 类分子复合体结合维持其组装,有利于( li)3九聚体形成。

在li(Invariant chain li)缺乏细胞中,GRP94结合MHC 类分子亚单位阻止其移出内质网。

防止自身肽引起免疫反应 9 。

3 热休克蛋白与抗原加工和呈递
免疫应答过程关键是抗原加工呈递,分为MHC 类途径和MHC 类途径,分别将抗原信息呈递给CD8+T细胞和C D4+T细胞。

MHC 类途径又有TAP(Transporter associated with antigen processing,TAP)依赖途径和非TAP依赖途径。

热休克蛋白不仅参与这两类途径,而且可作为抗原呈递分子直接将抗原肽呈递给 T细胞。

3 1 热休克蛋白与MHC 类途径
抗原加工首先在胞内泛素化,靶定在蛋白酶复合体降解成肽段释放出来。

蛋白N端偶联泛素, MHC 类分子对蛋白的限制性多肽呈递能力增强。

甲基化封闭泛素Lys48及抗原蛋白的Lys(Lysine,Lys)侧链氨基,泛素不能偶联蛋白,蛋白酶体对蛋白抗原降解及MHC 类分子呈递抗原肽能力降低。

Michalek 10 在泛素偶联缺陷的温度敏感型ts20细胞观察到:关闭泛素偶联,ts20细胞对进入胞质的卵白素呈递受抑制,而小基因编码的卵白素表位肽呈递却不受影响,这种泛素依赖的蛋白抗原降解实现对蛋白抗原的初步加工。

大量研究证实,HSP70、HSP90、gp96在MHC 类途径的抗原加工呈递中具有伴移抗原肽作用。

体内外实验证明,无论来自肿瘤细胞还是病毒感染细胞的HSP70提取物和gp96提取物能够激发特异的抗肿瘤抗病毒T细胞反应,而HSP本身不具有免疫原性且不受MHC分子的限制。

HSP70倾向结合1 6-3 2KD长抗原肽段,而HSP90和gp96则结合较为短的肽段 11 。

推测HSP参与MHC 类分子介导的抗原加工过程:胞质溶胶中抗原经泛素依赖的蛋白酶体水解后,抗原肽片段以依赖ATP方式与HSP70、HSP90分别结合并转运至内质网膜的TAP, TAP转运给内质网腔gp96,最后与MHC 类分子组装成稳定三聚体。

HSP具有的ATPase活性及可能的蛋白酶活性,对其结合前体抗原肽分子进行修剪;或者由内质网腔外肽酶进行修剪,使抗原肽适合与MHC 类分子结合,而gp96保护抗原肽免受酶降解,确保MHC 类分子在应激条件下结合异源或异常的自身抗原肽,增强呈递,打破宿主对病毒或肿瘤细胞的免疫耐受 12 。

HSP不仅参与TAP依赖途径,而且参与非TAP 依赖途径。

Schirmbeck 13 研究TAP-细胞(RMA-S)抗原加工呈递时发现,RMA-S细胞转染SV40-T Ag的变体c T及T272,细胞能够将这两种T Ag的T细胞表位以MHC 类分子限制途径呈递给CD8+T细胞,在胞浆内,cT和T272都与组成性表达HSC70形成复合物,当NH4Cl或氯喹抑制内体/溶酶体蛋白酶活性,此复合物大量聚集在体内,MHC 类限制抗原呈递亦受到抑制,在人TAP-T2细胞及鼠TAP-的C MT 64肺癌细胞亦得到类似结果。

这说明HSP70家族的亚型可能参与了非TAP依赖途径。

3 2 热休克蛋白与MHC 类途径
乳腺癌组织中存在突变P53/HSP70复合物时,则病人外周血中存在抗突变P53蛋白抗体。

PBP72/ PBP74参与MHC 类途径的抗原肽的加工呈递 14 。

巨噬细胞中HSC70的表达与MHC 类途径的抗原呈递密切相关,稳定转染hsc70基因的巨噬细胞中外源抗原与HSC70形成复合物明显增强外源抗原的呈递,ATP和免疫抑制剂(Deoxyspergualin)促进此复合物的解离。

综上所述,推测HSP70/HSC70通过保护并转运抗原肽的作用而直接或间接参与MHC 类途径的抗原呈递 15 。

3 3 热休克蛋白是抗原呈递分子
近年研究已发现许多非MHC分子亦具有抗原呈递作用,如:CD1等,HSP70家族具有类似MHC结合抗原肽的结构域。

可能作为抗原呈递分子直接将抗原肽呈递至细胞表面激发特异的 T细胞反应。

H-ras转化兔纤维肉瘤细胞(W31)作靶细胞,激发BCG致敏兔DNT(Double negative T cell),DNT C D3+ CD4-CD8-细胞对W31细胞的细胞毒作用。

抗HSC70抗体证实HSC70表达细胞表面且封闭上述细胞毒作用,这说明HSC70直接呈递抗原肽的作用 16 。

GRP75亦可作为抗原呈递分子,分别将人淋巴瘤SUB-B17细胞、转染有Ig 轻链基因或缺失信号序列I g 轻链基因的C1R(EB病毒转化的自身B细胞)细胞中Ig 轻链抗原肽呈递给病人自身 T细胞并被识别杀伤。

抗GRP75抗体可封闭 T细胞的识别杀伤作用;而抗MHC 类分子抗体及抗CD1抗体不能阻断 T细胞杀伤作用 17 。

热休克蛋白gp96特异结合抗原提呈细胞(APCs)表面gp96受体,机制与树突状细胞(DCs)表面的甘露糖受体对抗原的摄取相类似。

gp96具有ATPase活性,ATP水解提供能量使肽从gp96转移到MHC 类分子上。

人和小鼠的APCs如巨噬细胞(M )、DCs和B细胞能够结合gp96,肽特异性C TL 活化也需要APCs表面gp96受体的介导,它们可被未结合肽的gp96抑制。

这表明受体介导的gp96的内吞能指导与其结合的MHC 类抗原再提呈,并引起C TL活化,其抗原提呈效率比吞噬介导的提呈高10000倍 19,20 。

4 热休克蛋白与肿瘤免疫治疗
热休克蛋白在免疫应答中作用为临床上抗肿瘤和抗病毒免疫提供新思路和方法。

T细胞介导的特异性细胞免疫在肿瘤免疫中的重要作用已得到人们的共识,肿瘤中提取的热休克蛋白可能含有多种肿瘤特有抗原肽,作为瘤苗免疫机体,激发机体产生抗肿瘤特异的多个和多种C TL克隆( C TL和 C TL),有可能杀伤所有肿瘤细胞。

此瘤苗具有简便、易得、广谱,并且同种间不受MHC限制。

此方法对病毒疫苗的研制提供新思路。

热休克蛋白作为瘤苗的可行性在实验动物已得到证实 18 ,可望在不远将来应用临床。

虽然热休克蛋白在免疫应答中机制已得到初步阐明,但其中的关键步骤和详细机理仍有待进一步深入研究。

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