羊水细胞荧光原位杂交(FISH)实验步骤

未培养羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤

一、羊水标本玻片制备

1.Hanks胰酶消化：5-8ml未培养羊水标本离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀

物中加入5ml水浴加热至37℃的Hanks胰酶溶液（0.25%），充分混匀，37℃水浴

25min；

2.低渗：离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入8ml水浴加热至37℃的

低渗液（0.075M KCL），充分混匀，37℃水浴30min；

3.预固定：迅速加入1ml新鲜配制的固定剂（甲醇∶冰乙酸=3∶1），并立即轻柔混

匀细胞悬液，2500转/分钟离心10min，弃上清；

4.固定：加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，固定30分钟以上或

放置过夜，2800转/分钟离心10min弃上清，加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹

散细胞，并混匀，2800转/分钟离心10 min弃上清，根据细胞多少加入0.2-0.5ml

新鲜配制的固定剂，调至适宜浓度后滴片；

5.滴片：将2-3滴细胞悬液滴加在用冰水预冷的干净载玻片上，并立即将玻片放入

75℃的烤箱中，待表面干燥后取出编号；

6.烤片：将玻片放入60℃烤箱中烘烤2 hr；

7.Rnase A处理：标本玻片杂交区用40μl 0.1mg/ml RNAase A溶液（溶解于2×SSC）

于37℃处理30-50min，再用2×SSC于室温洗2min，依次放入 70%，90%，100%的

酒精中脱水各2min，室温晾干玻片。

8.胃蛋白酶消化：将玻片放入水浴加热至37℃的胃蛋白酶溶液（0.25%）中处理5min,

立即取出玻片，在室温条件下，依次将玻片放入2×SSC、70%、90%、100酒精中

各处理2分钟，气干玻片。

二、探针、玻片变性及杂交

9.探针变性：按试剂说明书配制探针液，于75℃水浴变性5min；

10.玻片变性：玻片于75℃变性液（70%甲酰胺/2×SSC）中变性5min，酒精梯度脱水

迅速风干玻片；

11.将已变性探针5μl加在玻片标本区，依次盖上小、大两层蜡膜，将大的那层四周

压紧，再用透明胶包扎密封玻片，放入湿盒中于37℃杂交过夜；

二、杂交后洗脱、DAPI复染和荧光显微镜观察信号

12.洗脱：小心揭去透明胶和蜡膜，玻片依次于洗脱液I(WS-I)中45℃洗3次×2min，

洗脱液II(WS-II)中25℃洗3次×2min,洗脱液III(WS-III)中25℃洗1次×2min，酒精梯度脱水风干玻片；

13.结果观察：加5μl DAPI（0.5mg/ml）复染，盖上盖玻片，20min后用荧光显微镜

观察信号，照像并计数。

相关试剂的配制

１．低渗液0.075M KCl 配制5L

称量28g KCL溶解于5 L 蒸馏水中。

２．固定剂甲醇:冰醋酸=3:1(V/V)

3．变性液（甲酰胺70%、2×SSC、0.1mM EDTA）

配制50ML变性液： 35mL甲酰胺/5mL 20×SSC（pH 7.0）/10μl ( 0.5M EDTA)

调节pH值至7.0~7.5，再加纯水补至50ML（其中EDTA可用也可不用）。

4．WS-I ：甲酰胺50%（v/v）、10%（v/v）20×SSC、40%（v/v）蒸馏水

5．WS-II ：４×SSC /0.０５% Tween-20

6．WS-III ：４×SSC

7. 10%（w/v）胃蛋白酶溶液

将10克胃蛋白酶粉剂充分解于100ml 0.01M HCL即可。溶

（注：0.01M HCL 的配制方法将0.862ml市售的浓盐酸稀释至1000ml即可。）

8. 20×SSC

在800ml水中溶解175.3g 氯化钠和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。