DHFR-CHO细胞无血清培养基及其关键组份的研究和应用

DHFR-CHO细胞无血清培养基及其关键组份的研究和应用

单克隆抗体药物的诞生为一些重要疑难病如肿瘤、自身免疫性疾病和烈性传染病等的治疗带来了新的手段和曙光,市场潜力和经济价值巨大,成为近年来增

长率最快的类生物技术药物。由于抗体药物的临床治疗剂量高达数十至数百毫克,其工业化生产的规模和效率将最终决定其产业化的成败,因此基于生物反应器的动物细胞大规模培养技术作为抗体药物工业化生产的核心技术,如何满足更快速、更高效、更高质地生产抗体药物的要求,已成为当前和未来动物细胞大规模培养及其药物生产技术发展的目标和竞争核心。其中,动物细胞无血清培养基及其关键组份的研究和开发,以更合理优化的培养基配方和流加策略,实现抗体药物的

低成本、高效率生产,成为动物细胞大规模培养过程开发和优化的重要环节。

为此,本文借助数学统计学方法,通过研究无血清培养基的快速高效开发技术,建立几种适合于DHFR-CHO细胞生长和抗体表达的无血清培养基基本组份,并在此基础上考察关键组份-柠檬酸铁和次黄嘌呤/胸苷对细胞生长和抗体表达的

影响,以进一步优化无血清培养基组成和适宜的流加培养策略,为最终建立经济

高效的动物细胞培养过程和抗体药物生产工艺奠定基础。首先,本文通过连续应用Plackett-Burman设计、最速上升法和中心组合设计3种数学统计学方法,建立了动物细胞无血清培养基快速高效开发技术,在成功开发5种能支持细胞稳定传代培养的无血清培养基基础上,通过进一步优化柠檬酸铁、次黄嘌呤/胸苷、和牛磺酸等3种对细胞生长具有显著正作用的影响因子,最终获得了一种优化的无血清培养基(OptM)组成,并采用生物反应器对OptM无血清培养基支持DHFR-CHO

细胞生长和抗体表达的效果进行了实验验证,批培养过程获得的最大活细胞密度达到3.93×106 cells/ml,最终抗体浓度达到251 mg/L,与商业HyClone(?)

SFM4CHOTM无血清培养基获得了相当的批培养结果。为了深入认识柠檬酸铁、次黄嘌呤/胸苷等关键组份在细胞培养过程中的作用,本文进一步实验考察了它们对DHFR-CHO细胞生长、代谢和抗体表达的影响及其作用机制,以优化无血清培养基和流加培养过程。

研究发现,当培养基中没有柠檬酸铁存在时,即使添加高浓度的转铁蛋白-铁(400mg/L)也不能有效支持细胞生长和抗体表达,说明柠檬酸铁是无血清培养基中一种不可或缺的必需组份,在支持细胞生长方面发挥了转铁蛋白-铁所没有的功能和作用,其根本在于解决了转铁蛋白-铁无法克服的铁吸收速率受限问题。首先DHFR-CHO细胞对柠檬酸铁的铁吸收速率远高于转铁蛋白-铁,在同等铁摩尔数条件下细胞对柠檬酸铁的铁吸收速率比转铁蛋白-铁高6倍多；其次细胞膜上的转铁蛋白受体mRNA水平受胞内铁离子浓度的调节作用偏弱,当培养基中只以转铁蛋白-铁为铁源时,即使胞内铁离子浓度过低,细胞也因不能及时有效地上调转铁蛋白受体nRNA水平,而限制对转铁蛋白-铁的铁吸收速率。另外,实验发现无血清培养基中添加的柠檬酸铁浓度控制在50-125mg/L范围内时,比较利于细胞生长、活性维持和抗体表达,且以75 mg/L最适宜,过低(0和25 mg/L)或过高(250和500 mg/L)的柠檬酸铁浓度都不利于细胞生长和抗体表达,且会引起细胞提前发生凋亡。

进一步研究发现,柠檬酸铁的作用主要在于改善细胞的生长特性,而对细胞的抗体比生产速率几乎没有影响,而且柠檬酸铁作用的发挥主要归功于铁离子和柠檬酸根离子两者结合后的共同作用,也即只有当铁离子和柠檬酸根离子之间充分反应生成柠檬酸-铁络合物后才能发挥其效用。通过比较弱铁螯合剂(柠檬酸)和强铁螯合剂(EDTA)对细胞的铁吸收利用和细胞生长、抗体表达所发挥的作用,

发现柠檬酸作为弱铁螯合剂更有利于细胞对铁的吸收和利用,同时也更有利于细胞生长和活性维持,从而提高抗体产量。此外,实验结果也说明,DHFR-CHO细胞更倾向于对三价铁的吸收和利用,不仅吸收速率较高,而且对细胞的生长、活性维持和抗体产量也较为有利。

对于无血清培养基中次黄嘌呤/胸苷对细胞生长、代谢和抗体表达所发挥的作用,本文研究发现,无血清培养基中低浓度的次黄嘌呤/胸苷(次黄嘌呤和胸苷浓度分别为10mg/L和2 mg/L,记为H10T2)能够显著促进细胞生长,但不影响抗体比生产速率,然而高浓度的次黄嘌呤/胸苷虽然能够显著提高抗体的比生产速率,但对细胞生长具有抑制作用,且在培养后期加速细胞死亡。批培养过程所获得的抗体浓度在添加低浓度次黄嘌呤/胸苷时达到最高,比不含次黄嘌呤/胸苷的对照实验(HOT0)提高了25.7%,其作用主要归功于良好的细胞生长。另外,实验也发现培养基中添加的次黄嘌呤／胸苷对批培养过程中的细胞代谢也有一定影响,在整个培养过程中培养前期(0-4 d)的葡萄糖和谷氨酰胺消耗速率以及乳酸和氨生成速率均远大于培养后期,且培养前期的代谢速率在添加低浓度的次黄嘌呤/胸苷(H10T2)时最低,细胞对葡萄糖的利用率最高,而添加的高浓度次黄嘌呤/胸苷(H100T20)则加速了细胞的代谢,同时也使细胞胞内的蛋白含量得到显著提高。

进一步分析发现,低浓度的次黄嘌呤/胸苷(H10T2)促进细胞生长的作用主要表现在培养初期的前2天,此时细胞的比生长速率明显较快,细胞周期的检测结果也表明此阶段处于S期的细胞比例(24 h和36h时)明显较高。为了了解无血清培养基中添加的次黄嘌呤/胸苷对细胞稳定性的影响,本文对长期传代培养过程中(传代40次)的细胞生长、抗体表达、抗体轻/重链mRNA水平和基因突变等特征进行了考察。研究发现,无血清培养基中添加的次黄嘌呤/胸苷并不会引起细

胞生长的不稳定,相反对细胞生长还具有明显的促进作用。

抗体比生产速率在前20代较为稳定,而此后则逐渐下降,至40代时其降幅达到40%,但抗体比生产速率的下降与培养基中是否添加次黄嘌呤/胸苷没有直接关系,反而因次黄嘌呤/胸苷促进细胞生长能在一定程度上提高抗体浓度

(20-25%)。实验进一步发现,长期传代培养后期细胞的抗体比生产速率下降与抗体重链(HC)的mRNA含量降低有关。另外,研究发现DHFR-CHO细胞在长期传代培养过程中的自然突变现象难以避免,其中添加次黄嘌呤/胸苷后能使细胞突变有所缓和,但是氨甲喋呤(MTX)会促使细胞突变的发生,而此时培养基中的次黄嘌呤/胸苷并不能抑制MTX引起的细胞突变。

最后,本文在上述研究结果基础上,一方面进一步优化培养基中的柠檬酸铁和柠檬酸浓度,另一方面采用次黄嘌呤/胸苷浓度分阶段控制的流加培养策略,最终在生物反应器中建立了基于次黄嘌呤/胸苷浓度分阶段控制的流加培养工艺,最大活细胞密度达到6.45×106cells/m1,最终抗体浓度达到632 mg/L,均显著高于原批培养过程,取得了满意效果。通过本文的研究工作,成功开发了一种具有自主知识产权、能够促进细胞生长和抗体表达并适于细胞长期稳定传代的无血清培养基,并且在生物反应器规模初步建立了经济高效的二阶段流加培养过程,为抗CD20单克隆抗体的产业化奠定了基础。同时,本文对柠檬酸铁、次黄嘌呤/胸苷在促进细胞生长、提高抗体表达方面所发挥作用的深入认识和分析,国内外尚未见相关报道,因此对于其它动物细胞无血清培养基的开发和优化也具有重要的借鉴意义。