大花蕙兰组织培养和快速繁殖方法

大花蕙兰组织培养和快速繁殖方法

大花蕙兰采用传统的分株繁殖，繁殖速度慢、周期长，尤其对国外新引进的优良品种，难以迅速占领市场、满足需求。大花蕙兰类组培快繁国内公开报道的仅限于虎头兰和‘水晶多芭’等个别品种，因其各种、品种间培养有很大差异，对于新品种‘西维亚’、‘玛利莲梦露’、‘蒙米拉丝’、‘女皇’的培养国内尚无报道，对大花蕙兰的系统研究也远远跟不上市场的发展速度，我们于1998年以新引进的优良大花蕙兰品种为材料，利用组织培养和快速繁殖技术，开展了大规模工厂化育苗的系统研究，提高了诱导成苗率和繁殖速度，大大降低了成本，使本项技术在市场中更具竞争能力和推广价值，并繁育出大量种苗，批量供应市场，为大花蕙兰工厂化育苗提供了科学依据与参考。

把母株放在温室内盆栽培养，于2月底～4月初陆续从母株上取8cm左右的新芽，从基部切离，用自来水冲洗，再用洗洁净溶液浸泡5min，自来水冲洗10min，剥去最外几层叶片，并剪去芽的上半段。然后在超净工作台上采用3步灭菌处理法处理:先在70%的酒精中处理6ｓ，立即投入10%次氯酸钠溶液中10min，稍加摇动，取出后用无菌水冲洗，剥去外层2～3片叶；再放入5%的次氯酸钠溶液5min，取出后无菌水冲洗，剥至最后一枚叶片；再放入1%的次氯酸钠溶液1min，取出后无菌水冲洗数次。以上次氯酸钠溶液中均加入Tween-60以利杀菌剂更有效地发挥作用。在无菌条件下剥出约5mm长的茎尖，以生长点为中心，用解剖刀把茎尖切成4个小方块，分别接入已准备好的培养基上。pH 5.2～5.6，蔗糖2%，琼脂条0.6%～0.85%，温度22～25℃，光照强度2000Lx，每日光照12h。

外植体接在附加一定激素配比的培养基上，20d左右外植体周围出现许多白色颗粒状愈伤组织，继续培养逐渐转为绿色，25d可形成大量原球茎，以后每隔20d进行一次继代培养，若继代不及时易形成不定芽，需在继代时切去，影响原球茎增殖，造成浪费。继代前观察统计试验结果。大花蕙兰对KT的敏感程度高于对6 BA的敏感程度，相同浓度的NAA下，KT用量稍微增减即会产生明显差异，低浓度的KT对原球茎增殖有明显促进作用，高于0.1mgL则会抑制其生长。最佳激素配比为KT0.05mg/L，NAA0.5mg/ L。

随机分切法虽操作快捷，但有大量切割过于碎小的培养块死亡；纵切法操作需细致、费时，但原球茎增殖数多，大小一致；碾压和井字型切割(底部不分开)原球茎增殖时间可缩短、可加快继代，但单个继代原球茎增殖倍数减少。

通过前期初步筛选后，选择以附加KT0.05mgL，NAA0.5mgL的最佳激素配比，把原球茎切块分别接种MS，1 2MS，VW，KC为基本培养基的培养基上，测试不同培养基种类对原球茎增殖的影响。结果表明:MS，1/ 2MS，VW，KC均可应用于原球茎增殖，但以KC效果最佳。MS，1 /2MS，VW也能分化和增殖原球茎，但增殖缓慢、色淡。附加香蕉泥对原球茎增殖有明显促进作用，使增殖倍数提高到4.22，且生长健壮，色泽深绿。

用固体培养基培养最差，增殖速度慢，且易导致原球茎块死亡，继代不及时易分化出芽，但适合芽和根的分化培养；液体培养增殖较快，但生长不够健壮，色黄绿，质地较疏松；半固体培养基(减少琼脂用量)最佳，原球茎增殖量大，

色深绿，健壮。每隔4～5d对半固体培养基的培养瓶震荡，摇动一次，生长增殖效果更好。

生长健壮的原球茎不切割接种在固体分化培养基上，10～15d可诱导出丛生芽，继续培养30d左右可发育成小苗，当培养瓶内丛生芽长出5cm左右时，将苗与新增殖的原球茎分开，原球茎继续增殖培养，苗转入生根壮苗培养基中，每瓶8～10个小苗，当苗长出5～6片叶，根长到3cm左右时，即可开盖于温室内炼苗。通过添加不同水平的NAA比较，以NAA0.2mg/L为最佳。

炼苗2d后即可将苗取出，用清水洗净根部的琼脂，植于温室苗床内，栽培基质为松针+苔藓+粗砂，苗床底部垫以碎石、碎砖块，用稀薄的营养液喷雾，每隔1周喷1次800倍的多菌灵溶液，温度保持在10～25℃，在大棚里亦可生长良好，1个月后统计移栽成活率可达98%以上。1年后上盆，栽培基质用泥炭土+蕨根+树皮，每周浇1次液肥。

分析讨论

(1)大花蕙兰属热带气生兰，靠根系附着在林中树木及岩石上生长，多数种类有内生菌共生。因此，外植体灭菌采用3步处理。据笔者经验，大花蕙兰外植体灭菌比其它植物有一定难度。我们曾采用抗生素处理，效果不佳。对于供试品种是否由于存在内生菌而引起外植体灭菌处理困难，以及内生菌在植物体内的分布传播情况有待进一步研究。(2)培养基添加香蕉泥对大花蕙兰增殖和分化有明显的促进作用，这与香蕉泥中的有机质和天然激素有关，同时能使培养物在适宜的酸性条件下生长。

(3)培养过程中，不同品种增殖、成苗及幼苗分生情况有一定差异。其中‘梦露’明显比其它品种增殖快且易分生子苗，‘索菲亚’增殖最慢，很少分生子苗，这可能与品种固有特性有关。(4)原球茎切块细小、稀疏的培养瓶内，群体生长较慢，而切块较大且密集的瓶内，生长十分健壮，表现类似于群体生长效应。因此切割时不可过细，直径要在2mm以上，每瓶可接种30多个培养块，可使瓶内营养得以充分利用。(5)接种时，采用大罐头瓶把培养块1次夹入或铲入，稍加晃动半固体培养基即可使培养块分散开来，既节约时间、成本，又降低了污染率。(6)用改良KC(无机盐减半)培养大花蕙兰，无机盐用量比其它报道用MS 培养基大大减少，增殖分化效果均佳。采用降低琼脂用量制成半固体培养基可简化接种步骤，而且培养块浸在培养基内，降低了培养块黄枯和切口褐化的机会。定期摇动培养瓶，能使培养瓶内营养得以充分利用。无机盐和琼脂在培养成本中占有很高的比例，采用以上技术可大大节约成本，利于大规模生产应用。(7)生产过程中，我们用自来水代替蒸馏水，用绵白糖代替蔗糖，用廉价的琼脂条代替琼脂粉，降低了成本，效果没有丝毫降低。由于大花蕙兰原球茎增殖不必用小容器和相对较高的罐头瓶，可用透光性好的大容器代替。(8)采用1次定植，不经移栽，可以减少对幼苗根系的损伤和节约人力。只要保证温室内相对湿度，对成活率无显著影响，但组培苗前期生长缓慢。根据赵杨景对3种内生菌与大花蕙兰共生对矿质营养吸收影响的研究，内生菌对吸收矿质营养、促进幼苗生长有明显的作用。我们拟对大花蕙兰内生菌的分离与再接种，以及如何缩短幼苗期、提早开花等进行进一步研究。